吳光翠，閆順華，嚴(yán)麗

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830054

玫瑰花瓣系維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，為薔薇科植物突厥薔薇RosedamasceneMill.或玫瑰R.rugusaThunb.的干燥花瓣[1-3]，為春、夏季初花期采收，陰干，除去花托、花萼、枯朽花瓣等雜質(zhì)。玫瑰花含有多種生物活性成分，具有理氣解郁、鎮(zhèn)靜安神、活血散瘀等功效[4-6]。傳統(tǒng)中醫(yī)使用玫瑰花蕾，但維吾爾醫(yī)則用盛開(kāi)的花瓣。維吾爾民族藥理論闡述玫瑰花為性平，主治膽液質(zhì)性疾病，如干熱性肝炎、神經(jīng)衰弱、頭暈?zāi)X脹、心悸失眠、心肌炎、結(jié)核引起的消耗性疾病、大便不通等，或黏液質(zhì)性疾病，如胃納不佳、消化不良，及各種風(fēng)濕疼痛、面色蒼自等[7-9]，因玫瑰花具有較高的藥用價(jià)值，在維吾爾醫(yī)學(xué)中具有悠久的藥用歷史，收載于《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版(第一冊(cè))[7]中，玫瑰花瓣檢測(cè)項(xiàng)只有性狀、檢查(雜質(zhì))，標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單。本研究以金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷3個(gè)主要黃酮類(lèi)成分作為指標(biāo)成分，建立用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定上述3個(gè)成分含量的方法，為玫瑰花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 藥材

10批不同產(chǎn)地玫瑰花瓣樣品，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所蘇來(lái)曼·哈力克主任藥師鑒定均為薔薇科植物突厥薔薇R.damasceneMill.或玫瑰R.rugusaThunb.的干燥花瓣，樣品編號(hào)、批號(hào)和產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 玫瑰花瓣樣品來(lái)源

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品金絲桃苷(批號(hào)：111521-201204，純度：93.9%)、槲皮苷(批號(hào)：111538-200301，純度：94.5%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；對(duì)照品異槲皮苷(批號(hào)：MUST-14070211，純度：95.2%)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純(Fisher公司)，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、Lab solution色譜工作站(日本Shimadzu公司)；1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)；XS205 DU型電子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；UPT-Ⅱ-20L型超純水機(jī)(成都優(yōu)普超純水科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

AgilentEclipse TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)。以乙腈-0.2%磷酸水溶液(15∶85)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按槲皮苷計(jì)算，不低于4000，分離度均大于1.5。分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。色譜圖顯示樣品中各目標(biāo)峰能夠較好的分離。

注：A.對(duì)照品；B.樣品(9號(hào))；1.金絲桃苷；2.異槲皮苷；3.槲皮苷。圖1 混合對(duì)照品和樣品(9號(hào))HPLC色譜圖

2.2 溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液配制 取金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成含金絲桃苷40 μg·mL-1、異槲皮苷80 μg·mL-1及槲皮苷80 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2供試品溶液配制 精密稱(chēng)取玫瑰花瓣藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，至25 mL棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取金絲桃苷對(duì)照品13.5 mg、異槲皮苷對(duì)照品14.5 mg及槲皮苷對(duì)照品10.9 mg，分別置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得金絲桃苷253.5 μg·mL-1、異槲皮苷290.0 μg·mL-1、槲皮苷218.0 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。

分別精密量取儲(chǔ)備液金絲桃苷6.0 mL、異槲皮苷15.0 mL及槲皮苷20.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得金絲桃苷30.4 μg·mL-1、異槲皮苷87.0 μg·mL-1、槲皮苷87.2 μg·mL-1的中間液。

分別精密吸取金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷對(duì)照品的儲(chǔ)備液2、6、10、14、18、22、26 μL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。

分別精密吸取上述3種溶液各10 μL注入液相色譜儀，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得各組分回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的濃度為檢出下限(LOD)和定量下限(LOQ)，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示3個(gè)成分均有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 線(xiàn)性關(guān)系考察

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷對(duì)照品的混合溶液(其中金絲桃苷30.42 μg·mL-1，異槲皮苷87.0 μg·mL-1，槲皮苷87.2 μg·mL-1)，按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10L，記錄金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積值，測(cè)得金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD分別為0.16%、0.14%、0.14%，顯示精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(9號(hào))溶液，室溫下放置，按照2.1項(xiàng)下色譜條件每隔4 h進(jìn)樣10L，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄金絲桃苷、異槲皮苷及槲皮苷的峰面積值，測(cè)得金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷峰面積RSD分別為0.55%、0.47%和0.56%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品(9號(hào))約0.5 g，按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果金絲桃苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%，RSD為1.4%，異槲皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.56%，RSD為1.3%，槲皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.70%，RSD為1.0%，黃酮類(lèi)總平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.45%，RSD為1.0%，測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的供試品約0.25 g(9號(hào)，金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%，異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.56%，槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.70%，合并計(jì)算3個(gè)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.45%)，共取9份，置于9個(gè)25 mL棕色量瓶中，分別加入80%、100%、120%混合對(duì)照品的甲醇溶液(金絲桃苷96.34 μg·mL-1；異槲皮苷276.0 μg·mL-1；槲皮苷328.32 μg·mL-1)，再加入甲醇適量，超聲處理30 min，放置室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[10-12]。按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果金絲桃苷平均回收率109.4%(n=9)，RSD為3.8%，異槲皮苷平均回收率為101.2%(n=9)，RSD為2.9%，槲皮苷平均回收率為105.7%(n=9)，RSD為3.2%，加樣回收率符合要求。

2.8 樣品測(cè)定

分別精密稱(chēng)取10批不同產(chǎn)地玫瑰花瓣粉末各0.5 g，按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC圖譜，外標(biāo)法計(jì)算含量，計(jì)算時(shí)代入水分百分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器在線(xiàn)檢測(cè)，金絲桃苷在206、256、355、486 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，異槲皮苷在206、256、354、657 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，槲皮苷在205、256、349、487 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，考慮到能在同一波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的含量，簡(jiǎn)化含量測(cè)定操作過(guò)程，故選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 供試品溶液制備方法的確定

分別對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，以選出最優(yōu)的供試品溶液制備方法。

取樣品(9號(hào))粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL棕色量瓶，共4份，分別加入甲醇、80%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液及80%乙醇水溶液，分別超聲處理30 min，放至室溫，加溶劑至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，依法測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷3個(gè)黃酮類(lèi)成分的總含量。測(cè)定結(jié)果中甲醇提取液的含量最高，為1.45%，故選用甲醇為提取溶劑。另取樣品(9號(hào))粉末0.5g，精密稱(chēng)定，置于25 mL棕色量瓶，共4份，加入甲醇適量，分別超聲處理10、20、30、40 min，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，依法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果超聲處理20、30 min，黃酮類(lèi)組分含量基本穩(wěn)定，且30 min略高，故超聲處理時(shí)間定為30 min。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果表明，金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷3個(gè)黃酮類(lèi)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.38%～1.94%，平均值為1.66%。10批樣品中產(chǎn)地為和田地區(qū)的有6批，其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.45%～1.94%，稍高于其他地區(qū)；同時(shí)10批樣品中，金絲桃苷的含量明顯小于異槲皮苷和槲皮苷的含量，而異槲皮苷和槲皮苷的含量相當(dāng)。

本研究建立的HPLC測(cè)定玫瑰花瓣中3個(gè)黃酮類(lèi)成分，方法簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性好，可為玫瑰花瓣藥材的質(zhì)量控制提供參考[13-15]。