滅活的雙歧桿菌對小鼠腸液中分泌型IgA水平的影響

孫 杰，王麗紅，官 娜，黃 敏*

（1. 大連港醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116013；2. 大連醫(yī)科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116027）

滅活的雙歧桿菌對小鼠腸液中分泌型IgA水平的影響

孫 杰1，王麗紅1，官 娜1，黃 敏2*

（1. 大連港醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116013；2. 大連醫(yī)科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116027）

為觀察滅活的雙歧桿菌對小鼠腸液中SIgA水平的影響，將小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫抑制動物模型，分別以新鮮BS肉湯培養(yǎng)基、耗盡培養(yǎng)上清（SCS）以及死、活雙歧桿菌菌液進行灌胃。采用雙抗體夾心法合并間接法檢測腸液中SIgA的含量。結果顯示滅活的雙歧桿菌與雙歧桿菌活菌均可提高免疫抑制小鼠腸液中SIgA的含量, 二者的作用效果差異無顯著性（P＞0.05），SCS也具有一定的免疫促進作用，但與雙歧桿菌活菌相比差異有顯著性（P＜0.05）。滅活的雙歧桿菌具有與雙歧桿菌活菌相同或相近的免疫學活性，兩者均可提高小鼠腸液中SIgA水平。

雙歧桿菌；滅活；免疫抑制；分泌型IgA

雙歧桿菌作為人和動物腸道中最重要的生理性細菌之一，在腸道內(nèi)參與宿主的消化、營養(yǎng)、代謝、吸收、免疫及抗感染過程。將雙歧桿菌作為生物反應調(diào)節(jié)劑經(jīng)口服或經(jīng)非胃腸道途徑給予宿主，可激活機體免疫系統(tǒng)中的淋巴細胞、巨噬細胞及NK細胞等多種免疫效應細胞，使之分泌IL-21、IL-22、IL-26、IFN-2[1]等多種細胞因子以及在粘膜表面產(chǎn)生分泌型IgA（Secretory IgA, SIgA）[2]，從而提高機體局部或全身的防御功能，發(fā)揮自穩(wěn)調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤效應。目前廣泛使用的雙歧桿菌活菌制劑存在著有效期短、含菌量不穩(wěn)定、易被其他細菌污染等缺點。本文主要通過研究滅活的青春雙歧桿菌DM8504對Balb/c小鼠腸液中SIgA水平的影響，以確定滅活的雙歧桿菌是否具有與活菌相同或相近的免疫學效應。

1 材料與方法

1.1 菌種

雙歧桿菌DM8504菌株為大連醫(yī)科大學微生態(tài)學研究所保存菌種。經(jīng)中國科學院微生物研究所鑒定，該菌株屬于青春型雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）。

1.2 實驗動物

純系Balb/c小鼠，6～8周齡，體重18～22g，雌雄各半，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑

Purified Mouse IgA、Rat Anti-Mouse IgA、Goat Anti-Mouse IgA、Rabbit Anti-Goat IgG-HRP均購自美國BD公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 雙歧桿菌培養(yǎng)

將雙歧桿菌接種至BS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h。將菌液4 000 rpm離心10 min，分離得到耗盡培養(yǎng)上清（Spent Culture Supernatant，SCS）備用。用PBS重懸雙歧桿菌沉淀，所得菌懸液分為活菌（Bifidobacteria, Bif）組和滅活菌（Heatkilled Bifidobacteria, HBif）組。將HBif組置于65℃水浴，30 min滅活處理（經(jīng)BS肉湯檢菌，證明無活菌存在，并且仍保持正常細菌形態(tài)）。將處理后的HBif組和Bif組菌液4 000 rpm離心10 min，棄上清，用SCS重懸雙歧桿菌沉淀，調(diào)整兩組菌懸液濃度均為1×109CFU/mL。

1.5 實驗動物分組與造模

將50只純系Balb/c小鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為生理鹽水（NS）組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、耗盡培養(yǎng)上清（SCS）組、滅活菌（HBif）組、活菌（Bif）組。NS組小鼠腹腔注射無菌NS 0.3mL/只，其余四組小鼠分別腹腔注射CTX溶液（5 mg/mL）0.3 mL/只，1次/天，連續(xù)3天。從第4天起NS組和CTX組小鼠用新鮮BS肉湯培養(yǎng)基灌胃，SCS組小鼠用SCS灌胃，HBif組和Bif組小鼠分別用1×109CFU/mL滅活的雙歧桿菌菌液和雙歧桿菌活菌液灌胃，均為0.5 mL/只，連續(xù)14天。

1.6 檢測小鼠腸液中SIgA水平

將免疫后的小鼠摘眼球處死，取盲腸和回腸末端5 cm腸段。將腸管內(nèi)翻暴露腸內(nèi)壁，用5mLNS沖洗腸內(nèi)壁20次。將所得沖洗液3000 rpm離心10 min，取上清，分裝5個冷凍真空干燥小瓶，1mL/瓶，經(jīng)冷凍真空干燥得粉末。測定時每瓶中加入0.5mLNS，使粉末完全溶解，得到檢測樣品。以雙抗體夾心法合并間接法檢測SIgA，具體操作按余賀等方法[3]，個別步驟略有改動。將200 ng/mL的Rat-Anti-Mouse IgA加入96孔板中，100 uL/孔，4℃ 24h。洗板3次，每孔中加入100 uL1%牛血清白蛋白（BSA）封閉板，37℃ 2h。洗板3次，將檢測樣品和不同稀釋度的標準品（0、5、10、20、40、80、160、320、640 ng/mL）加入相應的孔中，100 uL/孔，室溫（20～25℃）2h。洗板3次，每孔中加入100 ng/mL的Goat-Anti-Mouse IgA100 uL，室溫（20～25℃）1h。洗板3次，每孔中加入稀釋度為1:6000的檢測工作液即Rabbit-Anti-Goat IgG-HRP 100uL，室溫（20～25℃）1h。洗板3次，每孔中加入底物液TMB100 uL，避光，室溫放置15 min。加入50 uL終止液（2mol/LH2SO4），混勻后即刻（5 min內(nèi)）測量OD值（測定波長為450 nm）。

1.7 統(tǒng)計方法

所有結果均以均值±標準誤（X±SE）表示，多組間兩兩比較用q-test。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果

結果表明（見表1），CTX可降低小鼠腸液中SIgA的含量，與NS組相比具有顯著性差異（P＜0.01）。SCS、HBif和Bif均可提高免疫低下小鼠腸液中SIgA的含量，與SCS組相比，HBif和Bif的作用效果較強，具有顯著性差異（P＜0.01）。HBif與Bif相比，后者對SIgA含量的提高效果更明顯，但兩者無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 滅活的雙歧桿菌對小鼠腸液中SIgA水平的影響

3 討論

雙歧桿菌作為一種革蘭氏陽性益生菌，是人和動物腸道中正常菌群的重要組成部分。雙歧桿菌具有明顯的免疫賦活作用，可提高機體局部或全身的防御功能，發(fā)揮自穩(wěn)調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤效應。雙歧桿菌粘附于腸上皮細胞后，可穿越M細胞，從而激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)一系列免疫反應。目前已有實驗證實滅活的雙歧桿菌具有與活菌相同的粘附于腸上皮細胞的能力[4]。

分泌型SIgA作為粘膜免疫系統(tǒng)中的主要抗體類型之一，能抵抗腸道蛋白酶的分解作用，在粘膜免疫中起著重要的作用。然而除了母乳喂養(yǎng)嬰兒之外，機體獲得外源性SIgA的方式是非常有限的。主要是通過激活機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生內(nèi)源性SIgA，這種方式對宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟是非常有效的，而且其效應是長期的。由結果可知，小鼠經(jīng)雙歧桿菌灌胃后可刺激腸粘膜分泌大量的SIgA。E-JKO等認為雙歧桿菌對腸粘膜中的B細胞具有促有絲分裂活性，從而提高B細胞合成分泌SIgA的能力，這一過程需要CD4+T細胞及其分泌的多種細胞因子的參與[5]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)65℃30 min熱處理滅活的雙歧桿菌提高機體免疫力的能力絲毫不遜于雙歧桿菌活菌，表明雙歧桿菌作為益生菌制劑的常用菌種, 并非必須采用活菌，而且死菌本身具有極高的穩(wěn)定性和安全性, 這就為死菌制劑的廣泛應用奠定了基礎。此外，不僅雙歧桿菌可提高機體的免疫力，雙歧桿菌的SCS對機體的免疫力也有一定的調(diào)節(jié)作用，這與前期研究結果相一致[6]。

已有研究表明，在對數(shù)期時活菌的免疫活性高于死菌，而在靜止期時死菌的免疫活性高于活菌，但若想達到相同的免疫效應水平，死菌的濃度一般都需高于活菌[7]。由此可以推測，細菌的生長階段對其生物學活性有著較強的影響。細菌與細胞間的相互作用是由菌體表面的熱敏感結構介導的，然而其作用的強弱程度可能是由其中的耐熱成分決定的。因此，在靜止期經(jīng)熱處理滅活的較高濃度的死菌可具有與活菌相同的免疫學效應。

[1] PLANTINGA TS, VAN MAREN WW, VAN BERGENHENEGOUWEN J, et al. Differential Toll-like receptor recognition and induction of cytokine profile by Bifidobacterium breve and Lactobacillus strains of probiotics [J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2011, 18(4): 621-628.

[2] YANG H, LIU A, ZHANG M, et al. Oral administration of live Bifidobacterium substrains isolated from centenarians enhances intestinal function in mice [J]. Current Microbiology, 2009, 59(4): 439-445.

[3] 余賀, 謝少文, 楊貴貞, 等. 臨床免疫技術[M]. 上?？茖W技術出版社, 1982: 210-213.

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[6] 紀芳, 黃敏, 倫永志, 等. 滅活的雙歧桿菌對小鼠血清中細胞因子水平的影響[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2003, 15(2): 78-79.

[7] HALLER D, BODE C, HAMMES WP. Cytokine secretion by stimulated monocytes depends on the growth phase and heat treatment of bacteria: A comparative study between Lactic Acid Bacteria and invasive pathogens [J]. Microbiology and Immunology, 1999, 43(10): 925-935.

Effect of Heat-killed Bifidobacterium on the Production of SIgA in Intestinal Juice of Mice

SUN Jie1, WANG Li-hong1, GUAN Na1, HUANG Min2*

(1.Department of Clinical Laboratory, Dalian Port Hospital, Dalian 116013, China; 2. Department of Microbiology, Dalian Medical University, Dalian 116027, China）

To explore the effect of heat-killed bifidobacteria on the production of SIgA in intestinal juice of mice. Got immunosuppressing mice by intraperitoneally in jecting CTX. Five groups of mice were administrated orally with fresh BS culture medium、SCS、heat-killed bifidobacteria and live bifidobacteria. Evaluated the production SIgA of by double antibody sandwich methods and indirect of ELISA assay. Both heat-killed bifidobacteria and live bif ido bacteria could increase the production of SIgA, but there was no significant difference between two groups (P＞0.05). SCS could improve the immunity of immunosuppressing mice in some degree, bu t it was a little weaker (P＜0.05). Heat-killed bifidobacteria and live bifidobacteria had the same or similar biological activity and both could improve the production of SIgA in intestinal juice of mice.

Bifidobacterium; heat-killed; immunosuppression; secretory IgA

Q939.9

A

1008-2395(2012)03-0053-03

2012-04-10

孫杰（1978-），女，主管檢驗師，研究方向：臨床微生物檢驗。

黃敏（1955-），男，教授，博士生導師，研究方向：生物因素抗腫瘤研究。