謝康

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518000）

1 可見分光光度計(jì)的原理

可見分光光度計(jì)是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)潔、使用方便的單光束分光光度計(jì)，基于樣品對(duì)單色光的選擇吸收特性可用于對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析。其原理是：當(dāng)一束單色光照射待測(cè)物質(zhì)的溶液時(shí)，當(dāng)某一定頻率(或波長(zhǎng))的可見光所具有的能量(hf)恰好與待測(cè)物質(zhì)分子中的價(jià)電子的能級(jí)差相適應(yīng)(即ΔE=E2-E1=hf)時(shí)，待測(cè)物將對(duì)該頻率(波長(zhǎng))的可見光產(chǎn)生選擇性的吸收。用可見分光光度計(jì)可以測(cè)量和記錄其吸收程度 (吸光度)。由于在一定條件下，吸光度A與待測(cè)物質(zhì)的濃度C及吸收地長(zhǎng)度l的乘積成正比，即A＝KCL，所以，在測(cè)得吸光度 A后，可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比較法以及標(biāo)準(zhǔn)加入法等方法進(jìn)行定量分析。

2 檢定前對(duì)儀器波長(zhǎng)進(jìn)行粗略檢查

可見分光光度計(jì)的波長(zhǎng)準(zhǔn)確度是很重要的；特別在比較儀器時(shí)，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度顯得更加重要。因?yàn)槲镔|(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光吸收時(shí)，有不同的摩爾吸光系數(shù)。我們知道，分光光度計(jì)分析測(cè)量的原理是基于郎伯-比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A=-lg（I/I0）=-lgT=klc

其中：

A-物質(zhì)的吸光度

I0-入射的單色光強(qiáng)度、

I-透射的單色光強(qiáng)度

T-物質(zhì)的透射比

k-物質(zhì)的吸光系數(shù)

l-被分析物質(zhì)的光程

c-物質(zhì)濃度

郎伯-比爾定律適用的前提條件是單色光，從公式中可以看出如果光的波長(zhǎng)發(fā)生變化，將直接影響吸光度及物質(zhì)濃度的測(cè)量結(jié)果，由此可見光的波長(zhǎng)示值誤差在分光光度計(jì)檢定與使用中的重要性。針對(duì)某些廠礦企業(yè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件差，磁場(chǎng)、震動(dòng)、腐蝕性氣體對(duì)儀器的影響且使用比較頻繁，容易造成儀器出現(xiàn)故障的情況，為了提高工作質(zhì)量和效率，在檢定前，應(yīng)首先粗略檢查儀器的光路，如果沒有大的問題，可進(jìn)一步按規(guī)程進(jìn)行檢定，如果不符合要求，應(yīng)先粗略調(diào)整光路后再進(jìn)行檢定，這樣可提高工作效率，收到事半功倍的效果，具體的方法是：

將儀器波長(zhǎng)置于580nm處，狹縫置于2 nm處（如果是可見分光光度沒有必要），打開試樣室蓋，用一張白紙插入?yún)⒈裙饴坊驑悠返墓饴分醒?，這時(shí)在白紙上應(yīng)看到一個(gè)清晰明亮完整的長(zhǎng)方形橙黃色光斑。在紫外區(qū)一樣，應(yīng)看到一個(gè)亮度稍暗的長(zhǎng)方形橙黃色光斑，當(dāng)手動(dòng)波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方面變動(dòng)時(shí)，應(yīng)看到光斑的顏色由黃變紅，繼之當(dāng)手調(diào)波長(zhǎng)向短波方面時(shí)，應(yīng)看到光斑顏色由紅變黃向紫色變化。如果儀器波長(zhǎng)檢測(cè)能如上所述順利完成，則說明儀器光路基本正常，波長(zhǎng)示值誤差應(yīng)在2nm范圍以內(nèi)。

3 儀器波長(zhǎng)調(diào)整后，要通知該儀器操作人員

在定量分析中，雖然出現(xiàn)了許多功能先進(jìn)的分光光度計(jì)，但在企業(yè)的一線分析中，更多的仍是采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，它是基于求得一組標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的吸光度與被測(cè)樣品的吸光度進(jìn)行比較，而得到被測(cè)物質(zhì)含量的一種方法，也是分光光度法定量分析中最經(jīng)典的方法，它的理論依據(jù)仍是郎伯-比爾定律。在檢定中，如果發(fā)現(xiàn)儀器波長(zhǎng)示值超差，需要調(diào)整，在調(diào)整波長(zhǎng)后，檢定人員如果沒有及時(shí)告知對(duì)方，對(duì)方可能仍使用以前的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果嚴(yán)重偏離。可見一定要及時(shí)告訴該儀器操作人員或質(zhì)管人員，波長(zhǎng)調(diào)整后應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線才能進(jìn)行下一次檢測(cè)，否則檢測(cè)結(jié)果將會(huì)出現(xiàn)較大偏差或失誤。因?yàn)樵瓨?biāo)準(zhǔn)曲線是在波長(zhǎng)調(diào)整前繪制的，現(xiàn)在波長(zhǎng)調(diào)整后，與原來相比吸光度將隨之發(fā)生變化，可見檢測(cè)結(jié)果不單純與儀器有關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇、配制、稱量以及如何正確使用儀器等方面都有關(guān)系。

4 要重視對(duì)比色皿成套性的檢定

在分光光度計(jì)的檢定中，我們往往重視對(duì)儀器本身的檢定，而容易忽視對(duì)儀器配套使用的比色皿成套性的檢定，這也是造成儀器分析結(jié)果偏離或超差的一個(gè)重要因素。很多企業(yè)操作人員由于對(duì)儀器結(jié)構(gòu)及分析原理了解不夠，也容易忽視這一問題，從公式中不難看出，如果比色皿杯子的尺寸以及透光性發(fā)生變化，將直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在檢定中，有時(shí)會(huì)遇到企業(yè)反映檢測(cè)結(jié)果有問題，懷疑是儀器波長(zhǎng)超差，但到現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)我們認(rèn)真反復(fù)對(duì)儀器進(jìn)行檢定后，發(fā)現(xiàn)儀器各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)沒有大的問題，基本符合規(guī)程的要求，再檢查溶液的配制，也沒有發(fā)現(xiàn)較大的問題，最后發(fā)現(xiàn)配套使用的兩個(gè)比色皿杯，從外觀上看顏色深淺不一致，經(jīng)檢定后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)比色皿示值誤差在10%左右，嚴(yán)重超差。經(jīng)詢問得知，造成這兩個(gè)杯子顏色不一致的原因是：企業(yè)操作人員習(xí)慣做法是盛放參比溶液與盛放樣品溶液的比色皿長(zhǎng)期固定不變且不注意及時(shí)清洗，因而造成盛放樣品溶液的比色皿杯由于污染程度相對(duì)嚴(yán)重而使比色皿表面顏色變深，久而久之，兩個(gè)比色皿透射比出現(xiàn)較大的誤差。針對(duì)這一情況，我們告訴企業(yè)操作人員，配套使用盛參比液比色皿與盛樣品溶液的比色皿杯不是固定不變的，可以互換使用，但必須保持清潔，用完后應(yīng)及時(shí)用蒸餾水作參比檢查其成套性，其誤差不應(yīng)超過0.5%，這一點(diǎn)在規(guī)程上是有明確規(guī)定的。另外，比色皿透光面如遭到污染，應(yīng)使用蒸餾水緩緩沖洗，然后再用潔凈而干燥的細(xì)布或?qū)Ｓ苗R頭紙輕輕擦凈，最好不要用毛刷或?yàn)V紙等硬性物質(zhì)擦拭，以免出現(xiàn)劃痕，造成比色皿報(bào)廢，使用完畢后，一定要及時(shí)給予清洗。清洗時(shí)，可用微量濃度的酸或一定濃度有機(jī)溶劑浸泡清洗，然后用蒸餾水沖洗，最后應(yīng)在干凈的環(huán)境中風(fēng)干，切勿用熱風(fēng)烘烤吹干，以免使吸收池形狀、尺寸發(fā)生微小變化，因而影響光程直至檢測(cè)結(jié)果。

5 檢定用計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)爭(zhēng)取得到更多的的信息，以便靈活使用

我們?cè)跈z定中發(fā)現(xiàn)，制藥行業(yè)使用紫外分光光度計(jì)較多，且大多數(shù)是進(jìn)口儀器，自動(dòng)化程度高，企業(yè)經(jīng)常會(huì)根據(jù)檢品的需要和《藥典》的規(guī)定，往往對(duì)儀器設(shè)定好使用條件，讓操作人員按部就班地操作，不允許隨意改變?cè)O(shè)定條件，以免儀器出現(xiàn)故障影響生產(chǎn)，這對(duì)企業(yè)管理來說是一件好事，但有時(shí)會(huì)給我們檢定工作帶來一定的困難，如何在這種情況下進(jìn)行檢定工作，就需要我們靈活地使用檢定規(guī)程。比如，大多數(shù)藥廠使用紫外分光光度計(jì)，參考結(jié)果經(jīng)常是吸光度值而不是透射比值，而我們的規(guī)程和檢定證書按常規(guī)給出的值卻是透射比值，這就為工作帶來不便。雖然二者之間可以互相換算，但在現(xiàn)場(chǎng)檢定中，為了更快、更便捷地了解儀器，我們的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)在上級(jí)部門檢定時(shí)，如果能在給出透射比標(biāo)準(zhǔn)值的同時(shí)再給出吸光度標(biāo)準(zhǔn)值更好。近年來，我們通過和上級(jí)檢定部門溝通，吸光度和透射比這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值同時(shí)給出，方便了現(xiàn)場(chǎng)工作。

6 波長(zhǎng)檢定時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)

在波長(zhǎng)檢定時(shí)，對(duì)于非自動(dòng)掃描儀器如721型、722型、751型、752型等儀器，檢定規(guī)程僅說明在波長(zhǎng)檢定點(diǎn)附近單向逐點(diǎn)測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的透射比或吸光度，而沒有明確說明檢定時(shí)波長(zhǎng)是從低到高進(jìn)行還是從高到低進(jìn)行為好。事實(shí)上二者均可以實(shí)施，但在具體操作時(shí)是不同的。對(duì)于從事檢定工作時(shí)間不長(zhǎng)的檢定員來說，后者操作有可能造成儀器光源或光電接收系統(tǒng)故障。所以，一般情況下，我們盡量選擇從低波長(zhǎng)點(diǎn)向高波長(zhǎng)點(diǎn)逐漸進(jìn)行，這樣光源強(qiáng)度是由弱到強(qiáng)、由小到大成漸進(jìn)變化，對(duì)儀器光電接收系統(tǒng)起到有益的保護(hù)作用，而不是由強(qiáng)到弱或由弱到強(qiáng)突變刺激儀器，以免對(duì)儀器光源和光電接收系統(tǒng)造成意外故障，給檢定工作帶來不便。

7 更換光源時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)

對(duì)于721型可見分光光度計(jì),鎢燈更換時(shí)除要仔細(xì)檢查電源線和鎢燈頭焊點(diǎn)是否接觸良好,還要注意燈絲豎線要垂直正確對(duì)準(zhǔn)橢圓形光窗,然后調(diào)整波長(zhǎng)至580nm，再調(diào)整燈架上的螺釘上下、前后、左右，直至能在比色皿槽看到方正明亮的橘黃色光斑。對(duì)于插拔件燈泡來說，例如722型、723型、752型等相對(duì)容易，一般情況僅需要調(diào)整燈的上下位置，使580nm時(shí)長(zhǎng)方形黃色光斑中心照在入射狹縫上即可。在更換氘燈時(shí)波長(zhǎng)仍調(diào)在580nm，狹縫調(diào)至最大，調(diào)整氘燈位置應(yīng)能在狹縫上看到微弱且完整的長(zhǎng)方形橘黃色光斑，但應(yīng)注意在更換氘燈時(shí)最好戴上防紫外線眼鏡，以免長(zhǎng)時(shí)間工作眼睛被灼傷。如果沒有防護(hù)眼鏡，要快速、短時(shí)間看準(zhǔn)位置調(diào)整、或稍停片刻讓眼睛休息后再調(diào)整。

結(jié)束語

綜上所述，分光光度計(jì)屬于實(shí)驗(yàn)室計(jì)量?jī)x器的一種，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)必須定期檢定，進(jìn)行量值溯源。只有熟練地操作儀器，定期檢定，才能確保儀器波長(zhǎng)的精確度，從而才能保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，同時(shí)還能及時(shí)發(fā)現(xiàn)儀器存在的問題。

[1] 吳文銘，紫外可見分光光度計(jì)的及其應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2009.07.

[2] 袁波，趙海鷹，竇曉鳴.紫外可見分光光度計(jì)的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2004.03.