周冬琴，莫海波，蘆治國(guó)，於朝廣，徐和寶，殷云龍

〔江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園），江蘇 南京 210014〕

墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum Tenore）為杉科（Taxodiaceae）落羽杉屬（Taxodium Rich.）植物。20世紀(jì)70年代，同屬植物落羽杉〔T.distichum（L.） Rich.〕和池杉（T.ascendens Brongn.）大量應(yīng)用于中國(guó)水網(wǎng)地區(qū)的綠化，隨即墨西哥落羽杉的應(yīng)用也逐漸引起人們的重視。20世紀(jì)60年代葉培忠教授開展了墨西哥落羽杉（♀）與柳杉（♂）的雜交育種研究［1-2］；20世紀(jì)70年代開始，江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所針對(duì)中國(guó)東部沿海灘涂面積廣和樹種資源缺乏的實(shí)際情況，開展了落羽杉屬樹種速生、耐濕、耐鹽堿品種的選育以及落羽杉（♀）與墨西哥落羽杉（♂）種間雜交等工作，并培育出‘中山杉302’和‘中山杉118’等新品種［3］，幾十年的品比試驗(yàn)、中間示范試驗(yàn)和江浙皖多點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)均表明這些雜種無性系具有觀賞價(jià)值高、速生、耐濕、耐鹽堿、抗風(fēng)力強(qiáng)、病蟲害少、材質(zhì)優(yōu)良和適應(yīng)性廣等特點(diǎn)［4-7］。為了進(jìn)一步豐富墨西哥落羽杉種質(zhì)資源，從2003年開始作者所在的研究小組先后從美國(guó)引進(jìn)墨西哥落羽杉種源3批，并篩選出17個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株。

雜交育種是通過不同個(gè)體間雜交創(chuàng)造變異和選育新品種的方法。雜交育種的物質(zhì)基礎(chǔ)是種質(zhì)差異，只有雜交親本間具有較多、較大的個(gè)體差異，才能創(chuàng)造出更多的變異。因此，育種材料遺傳多樣性的分析對(duì)于雜交育種親本選擇有著重要的理論指導(dǎo)意義。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為植物遺傳多樣性分析提供了可靠的技術(shù)手段，目前杉木遺傳育種研究工作中常用的分子標(biāo)記有RAPD［8-10］、RFLP［11］和 ISSR［12-13］等，但都存在一些不足，如：RAPD標(biāo)記的重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，檢測(cè)位點(diǎn)不多；RFLP方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要進(jìn)行DNA多種酶切、轉(zhuǎn)膜以及探針的制備等多個(gè)步驟，且僅能夠?qū)蚪M單拷貝序列進(jìn)行鑒定；ISSR分析方法在PCR擴(kuò)增時(shí)需要一定時(shí)間摸索最適反應(yīng)條件并且呈顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記是21世紀(jì)初誕生的新型DNA分子標(biāo)記，由美國(guó)加州大學(xué) Li和 Quiros開發(fā)［14］。該方法利用獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)方法對(duì)編碼基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，其多態(tài)性因個(gè)體間內(nèi)含子有無、大小及啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不等而異，較AFLP和RAPD等標(biāo)記更能反映表型的多樣性及進(jìn)化史。Ferriol等［15］利用11對(duì)SRAP引物組合分析了47份南瓜〔Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.） Duch.ex Poiret〕種質(zhì)，多態(tài)性達(dá)66.2％；Budak等［16］利用SRAP分析了53種野牛草〔Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.〕的遺傳多樣性，多態(tài)性高達(dá)95％。於朝廣等［17］利用48對(duì)SRAP引物對(duì)親本落羽杉與墨西哥落羽杉進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出29對(duì)多態(tài)性引物，其中的1對(duì)引物可對(duì)落羽杉與墨西哥落羽杉的4個(gè)雜交后代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定。因而，利用SRAP標(biāo)記可有效檢測(cè)種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

本研究旨在利用SRAP標(biāo)記對(duì)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為落羽杉屬雜交育種工作中優(yōu)良親本的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試18個(gè)單株均為墨西哥落羽杉的優(yōu)良單株。1～8號(hào)單株選自2003年引自美國(guó)加州的種源（原產(chǎn)墨西哥），于2004年分別種植于南京中山植物園實(shí)驗(yàn)苗圃和浙江寧波永豐園林綠化建設(shè)有限公司苗圃，其中1～6號(hào)單株選自浙江群體，7～8號(hào)單株選自南京中山植物園群體；9～17號(hào)單株選自2005年由美國(guó)奧斯汀州立大學(xué)提供的種源（原產(chǎn)美國(guó)新墨西哥州），于2006年播種于南京中山植物園實(shí)驗(yàn)苗圃；18號(hào)單株來源于南京中山植物園繁殖圃內(nèi)的墨西哥落羽杉大樹，為南京本地產(chǎn)墨西哥落羽杉（來源于南京東南大學(xué)校園內(nèi)）的扦插后代。

參照文獻(xiàn)［18］的方法確定優(yōu)良單株。通過簡(jiǎn)單的目測(cè)比較確定10棵候選樹，以候選樹為中心，劃定面積15 m×15 m的樣方10個(gè)，隨機(jī)測(cè)量樣方十字線上30棵樹的株高、胸徑和冠幅并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)候選樹的指標(biāo)位于該基本群體相應(yīng)指標(biāo)平均值加0.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上時(shí)則為優(yōu)良單株。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取及檢測(cè) 取新鮮嫩葉3～5 g置于液氮中快速研磨，采用CTAB法［19］提取總DNA并檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，然后溶解于TE緩沖液中，貯藏于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP引物篩選、擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)參考Li等［14］發(fā)表的引物序列篩選SRAP引物，引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。選取15條正向引物和5條反向引物（表1）組合成45對(duì)引物，從中篩選出7對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合對(duì)18個(gè)優(yōu)良單株總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 用于墨西哥落羽杉優(yōu)良單株總DNA SRAP標(biāo)記分析的引物序列Table1 Primer sequences used for SRAP marker analysis of total DNA from superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

采用Mastercycler ep PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積10μL，包括20 ng模板DNA、1×PCR緩沖液、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.2 mmol·L-1d NTPs、0.2 mmol·L-1引物和0.5 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)齊5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增產(chǎn)物在DYY-8B型電泳儀（江蘇南達(dá)生物技術(shù)開發(fā)公司）上采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓240 V，電泳時(shí)間2 h。電泳結(jié)束后參照文獻(xiàn)［20］采用快速銀染法顯色：先用含體積分?jǐn)?shù)10％乙醇和體積分?jǐn)?shù)0.5％冰乙酸的混合溶液固定12 min，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2％AgNO3溶液銀染12 min，水洗后用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5％ NaOH、體積分?jǐn)?shù)0.4％甲醛和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.02％ Na2S2O3的混合溶液顯色5～10 min至譜帶清晰，自來水沖洗后在Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）中觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)相同遷移率條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為“1”、無條帶的記為“0”，形成條帶的二元數(shù)據(jù)矩陣。在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下，采用POPGENE v1.32軟件計(jì)算多態(tài)性條帶數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和遺傳相似系數(shù)等；采用UPGMA分子系統(tǒng)聚類法由MEGA3.1軟件生成聚類圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 SRAP擴(kuò)增結(jié)果分析

選用18號(hào)優(yōu)良單株對(duì)所有引物組合進(jìn)行初篩，有30對(duì)引物組合有清晰的擴(kuò)增條帶；再用1號(hào)、3號(hào)、9號(hào)、12號(hào)和15號(hào)單株對(duì)初篩的30對(duì)引物組合進(jìn)行復(fù)篩，篩選出19對(duì)具有清晰條帶的引物組合；然后采用這19對(duì)引物組合對(duì)18個(gè)優(yōu)良單株進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出7對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好的引物組合（表2）用于18個(gè)優(yōu)良單株的SRAP分析。

表2 用于墨西哥落羽杉優(yōu)良單株SRAP分析的引物組合及擴(kuò)增結(jié)果Table2 Primer combinations used for SRAP analysis of superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore and amplification result

墨西哥落羽杉18個(gè)優(yōu)良單株的SRAP擴(kuò)增結(jié)果見表2。由表2可見：7對(duì)引物組合共擴(kuò)增出87條帶，多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性條帶百分率為81.6％。其中用引物組合Me09+Em10擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)均最多，分別達(dá)21和17條；用引物組合Me08+Em07、Me19+Em08和Me18+Em08擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，均只有9條；用引物組合Me18+Em08擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少，僅6條。引物組合Me08+ Em07和Me19+Em08擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率則達(dá)100.0％；引物組合Me18+Em08擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率最低，僅66.7％。

2.2 墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳差異分析

根據(jù)引種地和種植地將18個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株分為4組并采用SRAP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3。9～17號(hào)優(yōu)良單株的多態(tài)性條帶百分率（PPB）、觀察有效等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）最高，分別為64.4％、1.644、1.369、0.214和0.322；1～6號(hào)優(yōu)良單株的PPB、na、ne、H和I值居中，分別為52.9％、1.529、1.287、0.171和0.260；7號(hào)和8號(hào)2個(gè)優(yōu)良單株的PPB、na、ne、H和I值均最低，分別為25.3％、1.253、1.179、0.105和0.153；18號(hào)單株單獨(dú)成組，無法計(jì)算其PPB、na、ne、H和I值。18個(gè)優(yōu)良單株總體的PPB、na、ne、H和I值分別為81.6％、1.816、1.376、0.229和0.355。

表3 基于SRAP標(biāo)記的18個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳多樣性分析結(jié)果1）Table3 Analysis result of genetic diversity of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore based on SRAP marker1）

對(duì)4組18個(gè)優(yōu)良單株的遺傳分化分析結(jié)果顯示：基因分化系數(shù)為0.4799，即有47.99％的遺傳變異存在于群體間；種水平的基因多樣性為0.235；組內(nèi)的基因多樣性為0.122；基因流為0.542，表明各組間的基因交流比較少。

2.3 墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的聚類分析

墨西哥落羽杉18個(gè)優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表4。18個(gè)優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)為0.6322～0.9195，平均值為0.7539。其中，3號(hào)和9號(hào)單株的遺傳相似度最大，遺傳相似系數(shù)為0.9195；5號(hào)和18號(hào)以及7號(hào)和10號(hào)單株間的遺傳相似系數(shù)均最小，為0.6322，而18號(hào)單株與另外17個(gè)單株的遺傳相似系數(shù)均較低，遺傳差異較大。

根據(jù)18個(gè)優(yōu)良單株的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖1可見：在遺傳相似系數(shù)0.70處可以把18個(gè)單株分為3組：18號(hào)和14號(hào)單株分別單獨(dú)成組；其余的16個(gè)單株共同聚為1組。在遺傳相似系數(shù)0.80處又可把16個(gè)單株進(jìn)一步分為8個(gè)亞組：1號(hào)、7號(hào)、12號(hào)和15號(hào)單株各自單獨(dú)成亞組，2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和13號(hào)單株聚為1個(gè)亞組，4號(hào)和6號(hào)單株、8號(hào)和17號(hào)單株、10號(hào)和16號(hào)單株各自聚為1個(gè)亞組。

表4 墨西哥落羽杉18個(gè)優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離1）Table4 Genetic sim ilarity coefficient and genetic distance among eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore1）

續(xù)表4 Table4（Continued）

3 討論和結(jié)論

由于落羽杉屬樹種具有干型直、材質(zhì)好、耐鹽堿和耐水濕等優(yōu)良特點(diǎn)，自引入中國(guó)以來一直倍受林學(xué)界的關(guān)注。為培育滿足國(guó)內(nèi)生態(tài)環(huán)境建設(shè)需求的樹種，江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所持續(xù)進(jìn)行了落羽杉屬種間雜交的研究工作［21-23］，培育出‘中山杉302’、‘中山杉401’、‘中山杉405’、‘中山杉406’和‘中山杉407’等新品種［3，24］。隨著落羽杉屬雜交育種工作的進(jìn)一步深入，需要不斷豐富雜交親本的遺傳多樣性，為此作者所在研究中心先后從美國(guó)引進(jìn)墨西哥落羽杉種源3批。為了明確現(xiàn)有墨西哥落羽杉的遺傳多樣性狀況，作者通過基因組總DNA的SRAP標(biāo)記對(duì)18個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果顯示：18個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.229，Shannon信息指數(shù)為0.355，遺傳相似系數(shù)為0.6322～0.9195，與周玉珍等［10］利用RAPD標(biāo)記對(duì)53個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良無性系進(jìn)行的遺傳分析結(jié)果類似。說明引種可以有效豐富國(guó)內(nèi)現(xiàn)有墨西哥落羽杉種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

在供試的18個(gè)優(yōu)良單株中，18號(hào)單株為目前國(guó)內(nèi)樹齡最大的1株墨西哥落羽杉的無性系后代，存在生理年齡老化的問題。聚類分析結(jié)果表明：目前新篩選出的優(yōu)良單株（1～17號(hào)優(yōu)良單株）與18號(hào)優(yōu)良單株間的遺傳差異較大，這為選配新的雜交組合、培育優(yōu)良品種及創(chuàng)造優(yōu)良變異類型奠定了遺傳基礎(chǔ)。

根據(jù)聚類分析結(jié)果可將18個(gè)單株分為3組8亞組，每個(gè)亞組中的單株遺傳關(guān)系均較近，因此在選配雜交組合時(shí)可以選擇遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的單株，以避免雜交親本單一等問題，從而在有限的土地資源和人力資源條件下創(chuàng)造更多的優(yōu)良雜交組合。

18個(gè)優(yōu)良單株的聚類分析結(jié)果與其引種地和種植地的相關(guān)性不明顯，這可能與本研究中優(yōu)良單株的選擇和引物的選擇有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)篩選出的引物組合數(shù)較少，對(duì)研究結(jié)果有一定的影響，因此，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大引物篩選的范圍，對(duì)墨西哥落羽杉親本和雜交墨西哥落羽杉進(jìn)行更為精確的遺傳分析。

圖1 18個(gè)墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

［1］中國(guó)樹木志編委會(huì).中國(guó)主要樹種造林技術(shù)：上冊(cè)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1978.

［2］陳永輝，王名金，伍壽彭.落羽杉屬的引種和選育［J］.江蘇林業(yè)科技，1988，15（2）：43-47.

［3］陳永輝，伍壽彭，王名金，等.中山杉302和401無性系在堿地上的生長(zhǎng)和適應(yīng)性的初步研究［J］.江蘇林業(yè)科技，1989，16（3）：14-18.

［4］陳永輝，伍壽彭，殷云龍，等.江蘇濱海鹽堿地中山杉造林推廣試驗(yàn)［J］.江蘇林業(yè)科技，1996，23（4）：18-22.

［5］殷云龍，陳永輝.中山杉與池杉、落羽杉和水杉對(duì)比造林的調(diào)查和評(píng)價(jià)［J］.植物資源與環(huán)境，1997，6（3）：23-28.

［6］虞華強(qiáng)，費(fèi)本華，趙榮軍，等.中山杉和落羽杉木材解剖性質(zhì)研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2007，20（2）：213-217.

［7］於朝廣，殷云龍.落羽杉屬樹木種間雜交育種研究進(jìn)展［J］.江蘇林業(yè)科技，2008，35（2）：39-46.

［8］陳云鵬，潘士華，張建軍，等.利用RAPD檢測(cè)技術(shù)推測(cè)雜交落羽杉群落間的親緣關(guān)系［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，41（6）：641-646.

［9］李 涵，殷云龍，徐朗萊，等.落羽杉屬樹種及其雜交后代親緣關(guān)系的RAPD分析［J］.林業(yè)科學(xué)，2007，43（2）：48-51.

［10］周玉珍，李火根，張燕梅，等.墨西哥落羽杉無性系RAPD指紋圖譜的構(gòu)建［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，30（5）：29-33.

［11］LING Y，LUWF，LU F，et al.PCR-RFLP and AP-PCR of rbc L and ITS of rDNA show that×Taxodiomeria peizhongii（Taxodium× Cryptomeria）is not an intergeneric hybrid［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2006，48（4）：468-472.

［12］哀建國(guó)，邱英雄，余久華，等.百山祖冷杉的ISSR分析優(yōu)化和遺傳多樣性初步研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2005，31（3）：277-282.

［13］張 蕊，周志春，金國(guó)慶，等.南方紅豆杉種源遺傳多樣性和遺傳分化［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（1）：50-56.

［14］LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

［15］FERRIOLM，PICóB，NUEZ F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282.

［16］BUDAK H，SHEARMAN R C，GAUSSOIN R E，et al.Application of sequence-related amplified polymorphism markers for characterization of turfgrass species［J］.HortScience，2004，39：955-958.

［17］於朝廣，殷云龍，徐建華.用SRAP標(biāo)記鑒定落羽杉屬植物雜種［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（2）：142-146.

［18］國(guó)家林業(yè)局編委會(huì).全國(guó)森林培育技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)匯編：種子苗木卷［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：347-350.

［19］PATERSON A H，BRUBAKER C L，WENDEL J F.A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1993，11（2）：122-127.

［20］袁菊紅，權(quán)俊萍，胡綿好，等.石蒜SRAP-PCR擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，16（4）：1-6.

［21］CREECH D，YIN Y L.TaxodiumבNanjing Beauty’：a new landscape plant for the south［J］.HortScience，2003，38：1292-1293.

［22］殷云龍，尹曉明，於朝廣，等.中山杉302回交一代的早期選育［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003，12（2）：22-27.

［23］尹曉明，殷云龍，陳永輝.中山杉302和墨西哥落羽杉及其回交一代的同工酶分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2002，11（3）：59-61.

［24］於朝廣，殷云龍，徐建華.落羽杉屬4個(gè)新品種［J］.林業(yè)科學(xué)，2011，47（5）：181-182.