張婷，郭景陽，喬敏敏，楊宇，陳琳，李春梅，呂建新

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院生命科學學院，浙江 溫州 325035）

2型糖尿?。═2DM）是由肝臟葡萄糖產生增加、葡萄糖利用異常及胰島素分泌不足引起的[1]，以胰島素抵抗和胰腺β細胞功能失調為特征的疾病[2]。糖尿病患者在世界范圍內正在迅猛增加，2000年全球糖尿病患者總數為1.71億，預計到2030年將達到3億以上，其中T2DM約占90%[3]。2004年統(tǒng)計顯示，我國糖尿病人數約4000萬，但是根據2009年最新公布的數據顯示，我國糖尿病患者已經達到9400萬[4]，說明實際糖尿病發(fā)病率增長將比預計高出很多。因此，目前迫切需要安全無不良反應，能防治糖尿病尤其是T2DM的藥物。

有研究顯示，從荔枝中提取的小分子多酚在體內和體外均可誘導一些改變，如抗腫瘤細胞凋亡[5]、對小鼠的抗氧化和抗感染作用[6]、對運動員的抗疲勞作用[7]。越來越多的研究[8-9]顯示，荔枝核提取物有調節(jié)血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的作用。但是對于荔枝核對T2DM降糖作用的分子機制我們目前還不清楚。microRNAs（miRNAs）是一種小的內源性非編碼RNA分子，這些小的miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，可以有效地降低靶mRNA的水平，在基因表達調控中起到重要的作用，當然，miRNA本身的表達也受到嚴格的調控。大量研究已經證實，miRNAs與胰島素抵抗的形成密切相關。因此，我們通過追蹤檢測T2DM的理想模型db/db小鼠的體質量、攝食量、飲水量、空腹血糖、糖耐量和胰島素耐量的變化，并通過血清miRNAs芯片和Real-time PCR技術，初步研究荔枝核降低db/db小鼠血糖的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 荔枝核提取物50 g，由南京中醫(yī)藥大學植物藥研究與新藥開發(fā)中心暨南京植物藥深加工工程研究中心提供；血糖儀和血糖試紙；胰島素；50%葡萄糖溶液；RNA提取試劑盒（QIAGEN）；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連Takara公司；db/db小鼠由南京大學模式動物研究所提供，C57BL/6小鼠由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方案：實驗于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心完成。SPF級db/db小鼠8只和C57BL/6小鼠3只，雄性，鼠齡2個月左右，普通飲食，自由飲水。將小鼠分為3組：荔枝核處理組（db/db小鼠5只），未處理組（db/db小鼠3只）和正常對照組（C57BL/6小鼠3只）。分3籠飼養(yǎng)，編號并做好標記。荔枝核處理組用荔枝核提取物給予灌胃治療7周后給予去離子水灌胃3周，后繼續(xù)荔枝核灌胃2周，每只小鼠劑量為0.3 mL（含0.015 g荔枝核提取物溶于0.3 mL去離子水中），1次/d。未處理組和正常對照組一直給予等量去離子水灌胃。

1.2.2 體質量、攝食量、飲水量和空腹血糖檢測：體質量檢測：每周稱量小鼠體質量。攝食量檢測：灌胃3、6、9周時，每天上午9:00每籠小鼠給予50 g食物，第2天9:00稱量剩余的食物，繼續(xù)添加至50 g，連續(xù)5 d。飲水量檢測：灌胃3、6、9周時，每天9:00每籠小鼠給予200 mL去離子水，第2天9:00量取剩余的去離子水，繼續(xù)添加至200 mL，連續(xù)5 d?？崭寡菣z測：小鼠禁食整晚后，尾靜脈采血，檢測空腹血糖。

1.2.3 糖耐量和胰島素耐量試驗：糖耐量試驗：小鼠禁食整晚后，尾靜脈采血測定空腹血糖；之后腹腔注射50%葡萄糖（1 g/kg 體質量），于注射后30、60、90、120 min尾靜脈采血測定血糖。胰島素耐量試驗：小鼠禁食5 h后，尾靜脈采血測定空腹血糖；之后腹腔注射胰島素（1 U/kg體質量），于注射后30、60、90 min尾靜脈采血測定血糖。

1.2.4 血清Exiqon miRNAs芯片分析：血清miRNAs芯片檢測分析實驗流程：設計實驗基因芯片、制備RNA樣品（將荔枝核處理組和未處理組血清分別等量混勻后，取200μL血清提取總RNA）、標記miRNA、miRNA序列雜交、Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，獲取掃描圖片后進行數據分析。芯片的具體實驗步驟，委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.2.5 Sfmbt2表達水平：水合氯醛麻醉小鼠后，迅速分離肝臟和肌肉組織，用1% PBS清洗后保存在-80℃。提取肝臟和肌肉組織中總RNA，去除基因組DNA后逆轉錄成cDNA，通過Real-time PCR技術分析Sfmbt2表達水平的改變。用2-ΔΔCt來確定每個基因改變的倍數，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理方法 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據均用±s表示，兩組數據之間差異比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠體質量、攝食量和飲水量的影響 荔枝核灌胃治療后，荔枝核處理組體質量與未處理組db/db小鼠差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；攝食量與未處理組小鼠相比無明顯改變（P＞0.05）；荔枝核處理組在灌胃6周時與未處理組相比，飲水量明顯減少（P＜0.05）。各組小鼠體質量、攝食量、飲水量見圖1。

圖1 各組小鼠體質量、攝食量、飲水量結果

2.2 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠空腹血糖的影響 荔枝核灌胃治療后，db/db小鼠荔枝核處理組與未處理組相比，空腹血糖明顯下降（P＜0.05），與正常對照組比血糖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。并且在灌胃8～10周時荔枝核處理組db/db小鼠給予去離子水灌胃，其空腹血糖比未處理組也明顯下降（P＜0.05）。db/db小鼠荔枝核處理組血糖維持在相對較低水平，未處理組血糖維持在較高水平，正常對照組C57BL/6小鼠血糖維持在正常水平。各組小鼠空腹血糖見圖2。

圖2 各組小鼠空腹血糖結果

2.3 荔枝核提取物對db/db小鼠和C57BL/6小鼠糖耐量和胰島素耐量的影響 結果顯示，荔枝核處理組db/db小鼠糖耐量受損無明顯改善（P＞0.05），正常對照組C57BL/6小鼠糖耐量在正常水平。各組小鼠糖耐量結果見圖3。

圖3 各組小鼠糖耐量結果

與糖耐量結果相一致，荔枝核處理組db/db小鼠與未處理組相比，胰島素耐量受損無明顯改善（P＞0.05），正常對照組C57BL/6小鼠胰島素耐量在正常水平。各組小鼠胰島素耐量結果見圖4。

2.4 db/db小鼠血清miRNAs基因結果分析 荔枝核灌胃治療后，血清miRNAs芯片結果顯示，db/db小鼠荔枝核處理組與未處理組相比，有120個miRNAs表達水平出現明顯改變，其中上調的基因有71個，下調的基因有49個。見圖5，下調的基因中mmumiR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均來源于Sfmbt2的第10內含子，見圖6。

圖4 各組小鼠胰島素耐量結果

圖5 各組小鼠血清miRNAs所示差異表達的miRNAs聚類圖

圖6 Sfmbt2內含子所包含的miRNAs

2.5 荔枝核提取物對db/db小鼠Sfmbt2表達水平的影響 通過Real-time PCR發(fā)現db/db小鼠荔枝核處理組肝臟組織中Sfmbt2表達水平降低，下降為未處理組的64.4%；肌肉組織中Sfmbt2表達水平與未處理組相比無明顯差異。見圖7。

圖7 db/db小鼠Sfmbt2表達水平

3 討論

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，病死率僅次于腫瘤和心血管疾??；且其在發(fā)達和發(fā)展中國家均以指數形式增加，年輕化趨勢明顯[10]。荔枝核提取物有調節(jié)血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的作用。db/db小鼠是一種由leptin基因受體缺陷引起的先天肥胖性T2DM模型[11]。db/db小鼠存在明顯的糖代謝異常，其糖尿病的表現和病程與人類T2DM極為相似，是研究T2DM的理想模型[12]。因此我們通過給予db/db小鼠荔枝核灌胃治療，初步分析荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的可能機制。

我們的研究結果顯示，荔枝核處理組db/db小鼠體質量、攝食量無明顯改變，飲水量在灌胃6周時明顯減少，說明荔枝核提取物灌胃治療可以改善db/db小鼠的飲水情況，但是對體質量和攝食量并無明顯改善，考慮可能是灌胃的時間不夠或灌胃劑量不夠。

荔枝核灌胃治療后，db/db小鼠荔枝核處理組空腹血糖水平明顯下降，而未處理組血糖一直處于較高水平；正常對照組C57BL/6小鼠前后血糖無明顯變化。說明荔枝核有一定的降糖效果，可明顯降低db/db小鼠的空腹血糖，與之前研究中顯示的荔枝核的降糖作用一致[8-9]。并且在灌胃8～10周時荔枝核處理組db/db小鼠給予去離子水灌胃，其空腹血糖比未處理組也明顯下降，說明荔枝核灌胃治療一段時間后，即使不再給予荔枝核，其血糖也可以維持在相對較低水平。

然而，荔枝核處理組db/db小鼠糖耐量和胰島素耐量受損情況并未出現明顯改善，我們猜測可能是因為模型小鼠胰島素抵抗比較嚴重，短期內不易改善。

miRNAs是一類新發(fā)現的內源性基因表達調節(jié)分子，研究顯示，它與胰腺中胰島素分泌功能[13]、脂代謝[14-15]、糖尿病并發(fā)癥如糖尿病心臟病[16-17]、糖尿病腎病[18]及其他多種疾病均密切相關，因此近年來miRNAs被考慮作為診斷疾病或監(jiān)測病情進展的分子標志物。我們從血清miRNAs芯片表達譜中發(fā)現，db/db小鼠荔枝核處理組血清中miRNAs表達差異明顯，其中上調的基因有71個，下調的基因有49個，并且下調的基因中mmu-miR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均來源于Sfmbt2的第10內含子。之后我們通過Real-time PCR檢測結果發(fā)現，肝臟組織中Sfmbt2表達水平降低，肌肉組織中Sfmbt2表達水平無明顯差異，考慮血糖改變主要與肝臟代謝有關。db/db小鼠荔枝核灌胃治療后，其機制改變可能與Sfmbt2參與的機制有關，Sfmbt2基因是Polycomb group中的印記基因，它的早期胚胎遺傳父親的等位基因，晚期遺傳胚胎外組織[19-20]，然而對于荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的具體機制目前還不清楚，還需要進一步研究。

總之，本研究發(fā)現荔枝核可以明顯降低db/db小鼠的空腹血糖水平；并且，荔枝核灌胃治療后miRNAs及mRNA水平也發(fā)生改變。我們推測，荔枝核提取物對db/db小鼠的降糖作用可能與miRNAs及Sfmbt2表達變化有關，相關的機制還需要進一步研究。荔枝核是否可以作為一種新的口服降糖藥廣泛應用于T2DM患者，還有待于進一步的臨床驗證。

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