陳丹，黃飛飛，曹杰，黃少宇，章夢奇，譚峰

（溫州醫(yī)科大學，浙江 溫州 325035，1.第一臨床學院；2.基礎醫(yī)學院）

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的、嚴重危害宿主健康的人獸共患寄生蟲病。人們常因生食或半生食含有弓形蟲包囊的動物肉類而感染。

目前，微波爐已成為人們生活中的常用家用電器。研究證實，家用微波爐可有效地殺滅白色念珠菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等一些病原體[1-2]。因此，本實驗將經(jīng)過不同功率、不同時間微波處理后的弓形蟲PRU株包囊灌飼小鼠，并對感染小鼠從SAG1-PCR、抗弓形蟲IgG抗體效價檢測與腦組織包囊計數(shù)三方面來評價經(jīng)微波處理后的包囊是否仍具有感染性，探尋利用微波爐殺滅弓形蟲包囊的最佳條件，為家庭預防弓形蟲病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 弓形蟲蟲株與實驗動物 弓形蟲成囊株PRU株由本實驗室于小鼠體內常規(guī)保種。ICR小鼠，雌性，18～22 g，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 引物與試劑 根據(jù)弓形蟲SAG1參考核苷酸序列設計并合成引物，上游引物：5’-GCTGTAACATTGA GCTCCTTGATTCCTG-3’，下游引物：5’-CCGGAACAGTACT GATTGTTGTCTTGAG-3’，擴增片段長度為355 bp。格蘭仕微波爐（型號：wd900sl23-2；額定頻率：2450 MHz；額定輸出功率：900 W；額定輸入功率：1400 W）；弓形蟲抗體（Tox-IgG）ELISA檢測試劑盒購于珠海海泰生物制藥有限公司；DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）為Takara公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen公司合成；PCR檢測試劑盒為TianGen公司產(chǎn)品。

1.3 包囊收集 感染弓形蟲PRU株包囊的小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死，取腦組織勻漿，計數(shù)包囊總數(shù)。

1.4 微波爐處理包囊 實驗組共分8組，按不同溫度分為高溫組、中溫組與低溫組，其中高溫組分為30 s與1 min 2個處理組；中溫組分為1 min、3 min與5 min 3個處理組；低溫組分為1 min、5 min與10 min 3個處理組。將腦組織勻漿液分為8份，以0.9%氯化鈉溶液調整至250個包囊/（8 mL·份），按上述不同溫度、不同時間微波處理包囊。

1.5 動物感染 50只ICR小鼠隨機分成10組，5只/組，將上述微波處理后的包囊按50個/只灌飼小鼠。以未經(jīng)微波爐處理組作為未處理組（陽性對照組），陰性對照組只灌飼同等體積的0.9%氯化鈉溶液。灌飼當天作為第0天，記錄各組小鼠的存活時間。42 d后對存活小鼠進行以下評價實驗。

1.6 評價實驗

1.6.1 ELISA法檢測：42 d后，對存活小鼠眼眶取血，分離血清，按照Tox-IgG-ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中IgG抗體效價。

1.6.2 包囊計數(shù)：取血后將小鼠脫頸處死，制備腦組織勻漿，于低倍鏡下計數(shù)包囊總數(shù)。

1.6.3 PCR檢測：將各處理組與未處理組各取1 mL腦組織勻漿，按DNA提取試劑盒說明提取DNA。PCR反應體系：引物、dNTP、2×Master Mix?？傮w積為10μL，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。以直接提取的PRU株包囊DNA作為陽性對照。將5份陰性對照組DNA合成1份作為PCR的陰性對照。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組抗體效價差異比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠存活狀況 整個實驗過程中，低溫1 min組有2只小鼠死亡，分別死于感染后第13天和第39天；低溫10 min組有1只小鼠死于感染后第11天；未處理組有1只小鼠死于感染后第5天；其余小鼠感染后均未死亡，統(tǒng)一于感染后第42天處死。

2.2 腦組織內包囊計數(shù) 低溫1 min組小鼠腦組織包囊總數(shù)為（655.56±363.79）個/只，未處理組小鼠腦組織包囊數(shù)為（833.33±274.03）個/只，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其余各組存活小鼠腦組織內均未檢出包囊。

2.3 血清IgG抗體水平 低溫1 min組小鼠血清IgG抗體A450值為1.18±0.23，未處理組小鼠血清IgG抗體A450值為0.86±0.22，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其余各組ELISA法檢測結果均為陰性。2.4 SAG1-PCR結果 低溫組中只有低溫1 min處理組所有3個樣本中均檢測出弓形蟲SAG1基因，其余各組基因檢測均為陰性（見圖1）。而中溫各組（見圖2）、高溫各組（見圖3）都有部分樣本擴增出弓形蟲SAG1基因。

圖1 低溫組弓形蟲SAG1基因檢測結果

圖2 中溫組弓形蟲SAG1基因檢測結果

圖3 高溫組弓形蟲SAG1基因檢測結果

3 討論

弓形蟲病已成為人類第二大重要食源性疾病[3]。有研究證明，食入夾生肉不僅可引起弓形蟲病的暴發(fā)[4]，同時也是孕婦感染弓形蟲最可能的原因[5-7]。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的弓形蟲藥物和疫苗，故切斷傳播途徑顯得尤為重要。許多研究已證實微波爐能有效殺滅一些寄生蟲、細菌等微生物。張國華等[8-9]分別利用微波爐對肉中旋毛蟲幼蟲包囊和華支睪吸蟲囊蚴進行處理，證實微波爐對兩種病原體均有一定的殺滅作用。鑒于此，本實驗用微波爐處理弓形蟲PRU株包囊，以探索殺滅包囊的最佳條件。

弓形蟲抗體IgG和IgM是弓形蟲感染的重要血清標志物，其中IgG抗體雖產(chǎn)生時間較晚，但持續(xù)時間長，利用ELISA法檢測抗弓形蟲IgG抗體具有較好的敏感性及特異性[10]。本實驗ELISA法檢測結果顯示未處理組與微波爐低溫處理1 min組呈陽性，兩組血清IgG抗體A450值分別為0.86±0.22、1.18±0.23，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組均為陰性。鏡檢結果顯示未處理組與低溫1 min處理組的包囊數(shù)分別為（833.33±274.03）個/只、（655.56±363.79）個/只，且兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組均未查出包囊。通過將包囊檢查與IgG檢測結果對比發(fā)現(xiàn)，只有IgG效價高的組別檢測到包囊，表明低溫1 min不能殺傷弓形蟲包囊。

PCR技術作為一種新型的分子生物學方法，自誕生以來，由于它的特異性、敏感性、能在短時間內得到大量目的片段的優(yōu)勢，使之在弓形蟲檢測應用中得到廣泛應用，并取得較好的檢測效果。崔平等[11]就將PCR運用于豬弓形蟲病的檢測，其建立的方法以SAG1基因為引物最低能檢測到5個弓形蟲速殖子的DNA，且與相關的2種寄生蟲無交叉反應，具有高度的敏感性和特異性。鑒于此，本實驗將PCR技術用于對小鼠弓形蟲包囊感染的檢測，并在檢測過程中設立了陽性對照，陰性對照和未處理對照，結果顯示低溫1 min組均擴增出了目的基因，其結果與IgG-ELISA、包囊鏡檢結果一致，從而進一步證實低溫處理1 min的包囊仍然具有感染性。

然而，通過PCR技術檢測結果發(fā)現(xiàn)，在IgG-ELISA與包囊鏡檢結果均為陰性的高溫組、中溫組中均有部分樣本擴增出弓形蟲SAG1基因，特別是中溫5 min組中有1份樣本呈現(xiàn)陽性，但是低溫5 min組中所有樣品的基因檢測卻是陰性。因此，目前還不能妄下斷言其他條件就可以殺滅包囊。不難看出不管是鏡檢、ELISA法還是PCR技術都有一定的局限性，但PCR技術顯然具有更高的靈敏度。故在評價食物中是否有弓形蟲感染的時候不應僅憑某一種檢測方法來判斷，而應當加入基因檢測。

本實驗基因檢測部分結果與包囊計數(shù)和ELISA法檢測結果有一定出入，故可對ELISA法檢測結果顯示陰性而PCR技術檢測結果顯示陽性的樣本是否仍具有感染性進一步檢驗。此外，由于本實驗是將腦組織勻漿后采用固定體積（8 mL）放入微波爐進行處理，而實際生活中大多數(shù)為肉片，若將腦組織勻漿換成感染弓形蟲的小鼠肉片更接近實際，但在實際操作中很難得到有包囊的肉片；再者，本實驗微波處理的樣本均是常溫腦組織勻漿，與生活中冷凍肉解凍前的冰凍狀態(tài)有所不同，其微波處理想獲得相同處理效果，需要獲得更多熱量。由于市面上微波爐型號不同、功率不同、新舊不同，相同條件處理效果也必將不盡相同。另外，李榮芬等[12]證明，微波殺菌、殺死蟲體除了熱效應外，主要還有非熱效應—微波機制，故適當延長微波作用時間同樣可起到殺滅包囊作用。鑒于以上，在實際生活應用中應根據(jù)實際情況調整微波處理溫度和時間。

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