張秀霞，滕 芝，吳佳東，白雪晶

（中國(guó)石油大學(xué) 環(huán)境與安全工程系，山東 青島266580）

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)石油污染土壤的微生物修復(fù)的研究較多。但石油烴類污染物降解速率緩慢，治理時(shí)間較長(zhǎng)，是這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)突出缺點(diǎn)［1］。在微生物修復(fù)過(guò)程中，土著微生物較外來(lái)微生物有較高的適應(yīng)性，且污染物的早期降解主要由土著微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)?；谶@一想法，科學(xué)家開(kāi)始嘗試采用土著微生物進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的研究［2－5］。生物刺激是生物修復(fù)的重要策略之一，它是通過(guò)提供微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，或改善微生物生長(zhǎng)的環(huán)境條件，來(lái)刺激土著微生物的生長(zhǎng)，以迅速啟動(dòng)修復(fù)過(guò)程。生物刺激是當(dāng)前生物修復(fù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［6］。

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法可用于確定各因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)目標(biāo)值的影響［7］。在本研究中，通過(guò)向石油污染土壤中添加不同作用的激活劑來(lái)強(qiáng)化生物修復(fù)效果。筆者分析了各激活劑的強(qiáng)化效能，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)修復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，為修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表達(dá)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 供試土壤

供試土壤為勝華煉油廠原油罐區(qū)長(zhǎng)期被石油污染的土壤，石油烴含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為5．3%，其基本理化性質(zhì)列于表1。由表1可以看出，供試土壤的含水率較低［8］，C、N 質(zhì)量比（mC／mN）為55，氮含量相對(duì)較低［9］。實(shí)驗(yàn)前土壤樣品需經(jīng)過(guò)破碎、除雜、過(guò)篩及混勻處理。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil sample for test

在本研究中，以土壤樣品最初的石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w0）為基準(zhǔn)，測(cè)定經(jīng)過(guò)修復(fù)后該土壤樣品的石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)（wt），按式（1）計(jì)算石油殘留率η。

1．2 石油污染土壤修復(fù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程

由于供試土壤的氮含量相對(duì)較低，不利于微生物的代謝活動(dòng)，需添加氮源來(lái)調(diào)節(jié)mC／mN。

將混合均勻的供試石油污染土壤分裝到大小相同的、底部帶孔的花盆（每盆1kg）中，加入一定量的葡萄糖、H2O2、木屑和氮源。木屑均勻地撒到土壤中，氮源、葡萄糖用去離子水稀釋溶解，與H2O2均用噴霧器均勻地噴灑到土壤中，攪拌均勻，進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)。為了考察所添加葡萄糖、H2O2、木屑和氮源這4種激活劑對(duì)土壤修復(fù)效果的影響，得到其最佳添加量。修復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置處理組和對(duì)照組，對(duì)照組包括1個(gè)樣品，不添加任何激活劑；處理組包括12個(gè)樣品，其中添加不同量的激活劑。各樣品所添加激活劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和mC／mN值列于表2。

將處理組和對(duì)照組樣品在30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)30d，每天添加相同量的水，保持水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在16%～20%范圍，并攪拌1次，保持較好的通風(fēng)。第0、7、14、21、30d取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。采用超聲波萃?。贤夥止夤舛确y(cè)定土壤的石油烴含量，采用微生物黏著碳烴化合物法測(cè)定細(xì)菌的表面疏水性。

表2 石油污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)各土樣的激活劑用量Table 2 The amounts of activation agents used in strengthening bioremediation experiment of oil contaminated soil

1．3 響應(yīng)面優(yōu)化（RSM）設(shè)計(jì)

1．3．1 RSM因素水平的選取

通過(guò)上述對(duì)石油污染土壤樣品的修復(fù)實(shí)驗(yàn)，可得到幾個(gè)因素對(duì)石油烴降解影響情況，再根據(jù)Box－Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用RSM方法進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 RSM 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

以A、B、C為自變量，以石油殘留率（η）為響應(yīng)值，進(jìn)行17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的RSM實(shí)驗(yàn)，除因素水平的變化外，其實(shí)驗(yàn)條件與強(qiáng)化修復(fù)一致，第30d取樣測(cè)土壤中石油殘留率η，以確定石油污染土壤生物修復(fù)的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2 結(jié)果與討論

2．1 激活劑用量對(duì)石油污染土壤中石油烴生物降解的影響

在實(shí)驗(yàn)的第0、7、14、21、30d取樣，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)花盆中石油烴的殘留率，結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 mC／mN對(duì)石油污染土壤石油烴殘留率（η）的影響Fig．1 Influence of mC／mNon oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

圖2 葡萄糖用量對(duì)石油污染土壤石油烴殘留率（η）的影響Fig．2 Influence of glucose on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

圖3 H2O2用量對(duì)石油污染土壤石油烴殘留率（η）的影響Fig．3 Influence of H2O2mass fraction on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

圖4 木屑用量對(duì)石油污染土壤石油烴殘留率（η）的影響Fig．4 Influence of sawdust mass fraction on oil residual rate（η）of oil contaminated soil bioremediation

2．1．1 mC／mN的影響

由圖1可以看出，改變石油污染土壤的mC／mN可以提高其中石油烴的降解效果。當(dāng)mC／mN＝25時(shí)，石油烴降解效果最好，經(jīng)過(guò)30d，石油殘留率僅為42%左右，較對(duì)照樣提高了約40百分點(diǎn)，效果明顯。mC／mN過(guò)高會(huì)使?fàn)I養(yǎng)不能滿足微生物代謝需要，mC／mN過(guò)低，即氮素過(guò)多會(huì)造成一定的毒害作用，結(jié)果都使石油烴降解效果變差。選擇mC／mN＝25作為實(shí)驗(yàn)的最佳值。

2．1．2 葡萄糖的影響

由圖2可以看出，在石油污染土壤中添加一定量的葡萄糖對(duì)石油烴的降解有促進(jìn)作用。葡萄糖不僅可以作為外加碳源，而且還可以作為微生物代謝的中間產(chǎn)物［10］。葡萄糖添加量為0．3%時(shí)，石油烴殘留率明顯降低；隨著葡萄糖添加量增加，石油烴殘留率反而升高，而且在攪拌過(guò)程中，能聞到土樣有較明顯的酸味，為此，測(cè)定了第30d的土壤樣品的pH值以及細(xì)菌菌液的疏水性，結(jié)果列于表3。

表3 石油污染土樣添加葡萄糖修復(fù)30d的pH值及細(xì)菌菌液的疏水性Table 3 pH value of soil sample added glucose and bioremediation repaired for 30dand hydrophobic property of bacteria fluid

由表3可以看出，經(jīng)30d修復(fù)后土壤的pH值隨葡萄糖加入量的增加而下降；除添加0．3%葡萄糖土樣的菌液疏水性有所提高外，其他2個(gè)菌液疏水性均有所下降。較多的葡萄糖使得微生物代謝增加，產(chǎn)生了更多的酸性物質(zhì)，使土壤的pH值降低，從而抑制了微生物的活性；同時(shí)葡萄糖的加入改變了細(xì)菌合成的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征，使其表面疏水性下降［11］。但是葡萄糖作為營(yíng)養(yǎng)源又促進(jìn)了細(xì)菌的繁殖，使得石油降解率有所提高。選擇適宜的葡萄糖添加量為土壤質(zhì)量的0．3%。

2．1．3 H2O2的影響

H2O2本身可以氧化石油污染土壤中簡(jiǎn)單的石油烴化合物，其產(chǎn)生的氧氣又可以促進(jìn)土壤微生物的呼吸，提高其活性［2］。由圖3可以看出，添加一定量的H2O2能夠降低土壤中石油烴殘留率；H2O2添加量為0．5%的土樣經(jīng)30d修復(fù)，其石油殘留率比對(duì)照樣少約40%，而且添加量為0．3%和0．5%的2組土樣中修復(fù)效果相差不大，均比添加量為0．1%的效果好?？紤]到既能提高修復(fù)效果又要經(jīng)濟(jì)實(shí)用，選擇H2O2的最佳添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為土樣的0．3%。為了探究H2O2的作用機(jī)理，將H2O2添加量為0．3%的石油污染土壤培養(yǎng)10d，測(cè)定土壤中的脫氫酶活性和石油殘留率，結(jié)果列于表4。

表4 添加H2O2的石油污染土壤培養(yǎng)10d后的脫氫酶含量和石油殘留率（η）Table 4 Dehydrogenase mass fraction and oil residual rateηof oil contaminated soil with H2O2added after 10dbioremediation

由表4可以看出，添加H2O2且未滅菌以及濕熱滅菌后添加H2O2的土樣修復(fù)10d后，石油殘留率均比對(duì)照樣的低，前者脫氫酶含量比對(duì)照樣增加了50%，可見(jiàn)H2O2本身的氧化作用可以降解一部分烴類物質(zhì)。另一方面，由于H2O2自身獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，可作為電子受體催化微生物脫氫的酶活性［2］，進(jìn)而提高石油降解率，降低了土壤中石油烴的殘留率。

2．1．4 木屑的影響

從圖4可以看出，木屑的加入對(duì)提高石油污染土壤的石油降解效果也很明顯，但不同添加量對(duì)修復(fù)效果影響的變動(dòng)較大，以3%的添加量的效果最好；木屑加入量為5%時(shí)，可能使土壤的空隙過(guò)大，微生物集結(jié)于木屑表層，較難達(dá)到土壤中與石油污染物接觸，所以強(qiáng)化修復(fù)效果又變低。表5為添加木屑前后土樣中速效磷、蛋白質(zhì)以及有機(jī)質(zhì)的含量。

表5 添加木屑前后土樣中速效磷、蛋白質(zhì)以及有機(jī)質(zhì)的含量Table 5 The content changes of Available phosphorus，protein and organic matter in soil sample before and after sawdust added

由表5可以看出，添加木屑可以增加土壤的肥力，為微生物提供營(yíng)養(yǎng)；土壤中的蛋白質(zhì)、有機(jī)質(zhì)等有機(jī)成分的增加，可提高石油與木屑的接觸能力，從而使附著于木屑上的細(xì)菌更容易與石油接觸，增加其降解的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加木屑的土樣較濕潤(rùn)，這是因?yàn)槟拘季哂休^好的保水性，能避免水分的蒸發(fā)，維持生物的生長(zhǎng)需要。木屑的最佳添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為3%。

2．2 石油污染土壤生物修復(fù)的RSM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．2．1 RSM 的因素和水平

由圖1～4可以看出，4種激活劑的加入對(duì)土壤石油的降解均有一定的促進(jìn)作用。綜合激活劑的強(qiáng)化修復(fù)效果，選取對(duì)石油降解效果影響最顯著的mC／mN、w（H2O2）、w（Sawdust），將它們作為A、B、C3個(gè)因素，以＋1、0、－1分別代表變量的水平，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表6。

表6 石油污染土壤生物修復(fù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素與水平Table 6 Factors and their levels of the response surface methodology for bioremediation of oil contaminated soil

2．2．2 RSM 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

采用3因素3水平的RSM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表7，得到的響應(yīng)面分析圖形示于圖5。

表7 石油污染土壤生物修復(fù)得RSM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 7 Experimental results of RSM for bioremediation of oil contaminated soil

圖5 石油污染土壤生物修復(fù)的RSM分析所得的響應(yīng)面Fig．5 Response surfaces obtained from RSM analysis for bioremediation of oil contaminated soil

2．2．3 RSM回歸方程的建立與分析

利用軟件 Design expert 7．0對(duì)Box－Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得石油殘留率（η）對(duì)土壤m(xù)C／mN（A）、w（H2O2）（B）以及w（Sawdust）（C）的多元二次回歸方程，如式（2）所示。

式（2）中，η為石油殘留率的預(yù)測(cè)值；A、B、C分別是土壤m(xù)C／mN、H2O2和木屑的添加量。

通過(guò)對(duì)回歸方程中的回歸系數(shù)分析，可以得到該方程的R2＝0．9874。說(shuō)明該模型擬合良好，可用于預(yù)測(cè)和分析添加激活劑強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的情況。

對(duì)回歸方程的分析顯示，該模型穩(wěn)定點(diǎn)為一倒馬鞍形頂點(diǎn)，是極小值，從中可獲得最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)，即mC／mN為24．6，H2O2的加入量為0．32%，木屑加入量為2．9%。在此條件下，土壤強(qiáng)化修復(fù)30d后，石油殘余率的理論值為43．6%。同時(shí)，由圖5可以看出，二維圖的圖像接近于橢圓形狀，說(shuō)明影響因子的交互作用顯著；由圖形的緩陡程度可以看出3個(gè)因素對(duì)土壤石油降解率影響的顯著性，顯著性從大到小依次是mC／mN、H2O2的加入量、木屑加入量。

按照上述最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行2組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，30d取樣測(cè)定得到的石油殘留率為44．2%，與回歸模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件下石油殘留率43．6%非常接近。由此可見(jiàn)，該模型能較好的預(yù)測(cè)和分析添加激活劑強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的情況。

3 結(jié) 論

向石油污染土壤中適當(dāng)添加氮源、葡萄糖、H2O2、木屑4種不同作用的激活劑，能起到較好的強(qiáng)化修復(fù)作用，以氮源、H2O2、木屑的影響效果最明顯。用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的回歸方程可用于預(yù)測(cè)和分析添加激活劑強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的情況。

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