任玉蘭，彌春霞，張啟律，游 佳，李曉玲

（牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江157011）

土茯苓，又名冷飯團(tuán)、硬飯團(tuán)、山牛、禹余糧、山遺糧、赤土茯苓、光葉菝葜等，為百合科多年生常綠攀緣狀灌木，多生于山坡或林下，分布于我國(guó)安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、四川、云南省等，是北方傳統(tǒng)的清熱解毒中藥。土茯苓具有抗腫瘤、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)缺血心肌、免疫抑制、抗兒茶酚胺及抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用，可用于治療梅毒、淋濁、腳氣、疔瘡、冠心病、心絞痛、麻疹、急性細(xì)菌性痢疾和急慢性腎炎等［1］，對(duì)汞有一定解毒作用［2］，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫作用，其抗腫瘤作用與鞣質(zhì)含量有密切關(guān)系［3］。

鞣質(zhì)又稱單寧或鞣酸，是存在于植物界的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚化合物，具有收斂、抗菌、抗病毒、解毒、降壓、驅(qū)蟲、清除體內(nèi)自由基、抑制神經(jīng)系統(tǒng)、降低血清中脲素氮含量、抗炎等多種功能。

目前，土茯苓生藥學(xué)研究比較完善，但對(duì)土茯苓中有效成分的提取研究較少。鑒于此，作者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)土茯苓中鞣質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為土茯苓的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

土茯苓：產(chǎn)自安徽，購(gòu)于牡丹江市某藥店。

丙酮、濃氨水、乙酸鋅、氯化銨、乙二胺四乙酸鈉、濃鹽酸、鉻黑T、冰乙酸、三乙醇胺、鞣質(zhì)，均為分析純。

SHB－3型循環(huán)水真空泵，鄭州杜甫儀器廠；HS－11.6型電熱恒溫水浴鍋，山西交水醫(yī)療器械廠；TB－214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 土茯苓中鞣質(zhì)的提取流程

土茯苓干樣→粉碎→稱量→加入適量丙酮溶液→回流提取→減壓過(guò)濾（取濾液）→減壓蒸餾→含量測(cè)定。

1.3 提取工藝的優(yōu)化

固定其它條件，分別考察丙酮濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響；然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、丙酮濃度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，以鞣質(zhì)提取量為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化土茯苓中鞣質(zhì)的提取工藝。

1.4 鞣質(zhì)提取量的測(cè)定［4，5］

用移液管準(zhǔn)確移取20.00mL 1mol·L－1的乙酸鋅溶液于500mL容量瓶中，加入14mL飽和氨水，搖勻使白色沉淀完全溶解；將經(jīng)回流提取的鞣質(zhì)水溶液加蒸餾水稀釋到400mL，于水浴鍋中加熱至（35±2）℃，然后定量移入該容量瓶中，并不斷振搖，再置于恒溫水浴鍋中（35±2）℃溫?zé)峒s30min（間歇振搖數(shù)次），取出，冷卻至室溫，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用干濾紙過(guò)濾。

精密吸取濾液25.00mL于500mL錐形瓶中，加蒸餾水300mL、氨－氯化銨緩沖溶液（pH＝10）25mL、鉻黑T指示劑少許，搖勻后用濃度為0.05mol·L－1的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，當(dāng)溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色即為滴定終點(diǎn)，用空白校正。按下式計(jì)算鞣質(zhì)提取量（mg·g－1）：

式中：0.1556為每毫升1mol·mL－1的乙酸鋅溶液平均消耗鞣質(zhì)0.1556g；V0為空白對(duì)照消耗EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V為樣品消耗EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；cEDTA為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L－1；m為土茯苓樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 土茯苓中鞣質(zhì)的定性實(shí)驗(yàn)

將提取液分別與稀鹽酸、溴水、三氯化鐵、石灰水、乙酸鉛、甲酸和香草醛等在試管中進(jìn)行定性反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 土茯苓中鞣質(zhì)的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Qualitative experiment results of tannin fromSmilax glabra Roxb.

鞣質(zhì)可分為水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)。由表1可知，土茯苓中含有鞣質(zhì)，且基本為水解鞣質(zhì)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 丙酮濃度對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響（圖1）

圖1 丙酮濃度對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響Fig.1 Effect of acetone concentration on tannin extract

由圖1可知，隨著丙酮濃度的增加，鞣質(zhì)提取量先升高后降低，當(dāng)丙酮濃度為50%時(shí)，鞣質(zhì)提取量達(dá)到最大。因此，選擇丙酮濃度為40%、50%、60%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 料液比對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響（圖2）

由圖2可以看出，隨著料液比的減?。幢芤河昧康脑龃螅?，鞣質(zhì)提取量先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL，下同）時(shí)，鞣質(zhì)提取量達(dá)到最大。因此，選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 提取溫度對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響（圖3）

圖2 料液比對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on tannin extract

圖3 提取溫度對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin extract

由圖3可以看出，隨著提取溫度的升高，鞣質(zhì)提取量先升高后降低，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，鞣質(zhì)提取量達(dá)到最大。因此，選擇提取溫度為50℃、60℃、70℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響（圖4）

圖4 提取時(shí)間對(duì)鞣質(zhì)提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on tannin extract

由圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，鞣質(zhì)提取量先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為90min時(shí)，鞣質(zhì)提取量達(dá)到最大。因此，選擇提取時(shí)間為60min、90min、120min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、丙酮濃度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，以鞣質(zhì)提取量為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表2，結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.3 Result and analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表3可知，各因素對(duì)土茯苓鞣質(zhì)提取量的影響大小依次為：提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞丙酮濃度，即影響最大的因素是提取溫度，影響最小的是丙酮濃度。土茯苓的最佳提取條件為A3B1C2D2，即提取溫度70℃、丙酮濃度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取時(shí)間90min。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

稱取10g土茯苓于5個(gè)250mL圓底燒瓶中，加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90 min，抽濾后測(cè)定濾液中鞣質(zhì)提取量。結(jié)果見(jiàn)表4。

稱取10g土茯苓于5個(gè)250mL圓底燒瓶中，向各燒瓶中加入1mL鞣質(zhì)標(biāo)液，再加入40%的丙酮水溶液150mL，于70℃回流提取90min，抽濾后測(cè)定濾液中鞣質(zhì)提取量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)與加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the precision experiment and the standard addition recovery experiment

由表4可以看出，在優(yōu)化的提取工藝條件下，土茯苓中鞣質(zhì)的提取量為20.77mg·g－1，回收率為99.90%，方法可靠，重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定土茯苓中鞣質(zhì)的

最佳提取工藝為：提取溫度70℃、丙酮濃度40%、料液比1∶15（g∶mL）、提取時(shí)間90min，在此條件下，土茯苓中鞣質(zhì)提取量為20.77mg·g－1。該提取工藝經(jīng)濟(jì)可行，方法的精密度高、重現(xiàn)性好。

［1］張存莉，劉虎岐，傅建熙.藥用植物土茯苓研究進(jìn)展［J］.陜西林業(yè)科技，1999，（3）：60－63.

［2］徐笑飛，陳紅風(fēng)，葉媚娜.土茯苓解汞毒的研究概況［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（6）：750－753.

［3］張穎，張立木，丁靜，等.土茯苓中單寧含量的測(cè)定［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（3）：212－213.

［4］王家棟，于興博.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選榛子葉中鞣質(zhì)的超聲提取工藝［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，22（3）：313－314.

［5］馬彥梅，龔曉武，李炳奇.正交試驗(yàn)優(yōu)化沙棗果肉中鞣質(zhì)的超聲提取研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（2）：58－60.