章穎

肺癌位列全球癌癥相關(guān)死亡因素之首，五年生存率小于15%。其中，約 85%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者[1]。miRNAs是一類小的、非蛋白編碼的RNA，主要生理功能包括調(diào)控細(xì)胞和器官的生長、發(fā)育，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，參與代謝和應(yīng)激反應(yīng)等[2]。隨著分子水平研究的發(fā)展，臨床已逐步開始對非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行分類靶向治療，并取得部分成效。然而，潛在的腫瘤異質(zhì)性相關(guān)機(jī)制依舊為人所知甚少[3]。本文簡要概括了 miRNAs 與肺癌的研究歷史及研究成果；全面敘述了 miRNAs 在正常細(xì)胞和NSCLC 細(xì)胞中可能存在的作用機(jī)制；強(qiáng)調(diào)了 miRNAs 在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和預(yù)后判斷中起的作用；總結(jié)了miRNAs 對 NSCLC 患者的治療做出的貢獻(xiàn)；客觀地評價(jià)了 miRNAs 在NSCLC 中廣闊的臨床應(yīng)用前景及現(xiàn)今其科學(xué)研究仍舊存在的問題。

1 miRNA 與肺癌的研究史

自1993年Lee等[4]首次發(fā)現(xiàn) miRNA 以來，miRNA的來源、結(jié)構(gòu)及其基因調(diào)控作用隨之揭示。進(jìn)入 21 世紀(jì)，特別是 2005年以后，世界各國都掀起了 miRNA 研究的熱潮。如今，miRNA 已成為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵分子之一，參與了真核細(xì)胞中許多生物功能的調(diào)節(jié)，包括組織和細(xì)胞分化、發(fā)育以及機(jī)體的抗病毒作用等[5]。它幾乎涉及了肺癌的每一個(gè)進(jìn)程，如腫瘤進(jìn)展、血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移等步驟[6]。在過去的十年中，隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，關(guān)于miRNA 在NSCLC 中的研究涵蓋了對該癥的早期診斷、聯(lián)合治療及臨床研究、預(yù)后判斷等領(lǐng)域。截至 2011年，研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者與對照樣本的外周血有核細(xì)胞的miRNA 表達(dá)相比具有顯著差異，且部分已被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。

目前，肺癌分級系統(tǒng)對于肺癌的診斷和預(yù)后判斷仍略顯不足；有證據(jù)顯示，在腫瘤分型中，miRNA的表達(dá)譜比蛋白編碼基因表達(dá)譜更加準(zhǔn)確[8-9]。時(shí)至今日，大量分析研究都得出肺癌活組織中 miRNA的表達(dá)具有差異性這一共同結(jié)果[10-11]。這些都進(jìn)一步證明了 miRNA 作為肺癌的診斷及預(yù)后標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值，也提示了未來 miRNA 相關(guān)產(chǎn)品在肺癌治療臨床應(yīng)用中的廣闊前景。

2 miRNA 與NSCLC的發(fā)生發(fā)展

2.1 miRNA 在正常細(xì)胞中的基因調(diào)控機(jī)制

miRNA是一類在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)的單鏈非編碼 RNA，長度為19～25個(gè)核苷酸。研究表明，miRNA參與各種不同基因表達(dá)的調(diào)控，同細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。在細(xì)胞核中，原始 miRNA（pri-miRNA）在復(fù)合體（Drosha和Pasha/CGCR8）的作用下被剪切為前體 miRNA（pre-miRNA）；pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Exportin5等的幫助下轉(zhuǎn)運(yùn)出核，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在Dicer 酶的作用下進(jìn)一步被剪切成成熟雙鏈 RNA[13]。RNA 雙螺旋打開后，其中一條與RNA 誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）形成非對稱的RISC 復(fù)合物[14]。在大多數(shù)情況下，該復(fù)合體中的單鏈miRNA 會與靶 mRNA的3′UTR 形成不完全互補(bǔ)配對，從而阻斷基因的翻譯過程[15]。

miRNA 通過調(diào)控人體內(nèi)三分之一以上的基因，參與多種生物活動(dòng)過程[16]。2002年，Calin等[17]首次報(bào)道了miRNAs 在慢性 B 淋巴細(xì)胞白血病中的作用——易于出現(xiàn)突變、丟失的染色體 13q14 含有 miRNA-15a和miRNA-16。之后的大樣本研究發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)正常組織相比，miRNA 在不同類型、分期和預(yù)后的腫瘤患者中的表達(dá)譜有明顯差異[18-19]：miRNA 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)相對于對應(yīng)的正常組織細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)為下調(diào)，但亦可表現(xiàn)為上調(diào)；其改變是腫瘤發(fā)生的結(jié)果，同時(shí)，它還主動(dòng)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[20]。

2.2 miRNA 在NSCLC 細(xì)胞中的基因調(diào)控機(jī)制

在肺癌中，癌基因 Kras 與抑癌基因 p53的作用舉足輕重。20%～30% 肺腺癌患者存在Kras 基因突變現(xiàn)象，而在NSCLC 患者中，p53 失活則高達(dá) 50%[21]。核因子-κB（NF-κB）是肺癌形成過程的一個(gè)重要信號通路，若 p53失活，則 Kras 表達(dá)激活 NF-κB；此外，缺失 p53 會導(dǎo)致NF-κB的轉(zhuǎn)錄因子 p65 在核內(nèi)積累，通過影響蛋白激酶 MAPK 及PI3K 對細(xì)胞的增殖和蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生作用[22]。目前，與這兩個(gè)基因相關(guān)的miRNA 研究得最清楚的是 let-7。

NSCLC 中 miRNA的作用機(jī)制大致可以分為三類：即轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)調(diào)控和miRNA 自身的表達(dá)調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)主要有兩種方式：抑制翻譯或降解 mRNA。此外，與靶基因 mRNA的3′UTR結(jié)合的miRNA 還可能影響其穩(wěn)定性[23]。

miRNA 還可以通過甲基化靶基因即表觀遺傳學(xué)的改變影響肺癌的發(fā)生。Toyota等[24]發(fā)現(xiàn) miR-34b和miR-34a受 DNA 低度甲基化調(diào)控：這兩種miRNA的過度表達(dá)導(dǎo)致了 p53的沉默，繼而引發(fā)肺癌。

此外，miRNA的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與肺癌的形成也密切相關(guān)。Sun等[25]研究表明，成熟 miRNA 之外的堿基序列的改變亦能影響miRNA的生成和功能。同樣，靶基因的SNP 對 miRNA作用的影響亦不容忽視。let-7 與Kras 基因 3′UTR結(jié)合位點(diǎn) 6（LCS6）的SNP 對 miRNA 與Kras的結(jié)合有重要影響，因而對 Kras 基因的表達(dá)也產(chǎn)生極大作用[26]。Gao等[1]指出，抑癌因子如 miR-34、let-7、miR-218、miR-145、miR-15和miR-16，原癌因子如 miR-155、miR-21、miR-31等在非小細(xì)胞肺癌中均有明顯的含量變化。

3 miRNA 在NSCLC 診斷及預(yù)后判斷中的作用

3.1 miRNA 對非小細(xì)胞肺癌早期診斷的貢獻(xiàn)

在腫瘤早期危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)下，miRNA 即參與細(xì)胞基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)化，參與癌前病變的發(fā)生。Lu等[27]對 334 例腫瘤及正常組織的miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多種腫瘤均具有各自特征性的miRNA，這對肺癌的診斷分型有重要的作用。除癌組織外，血清 miRNAs 也是最近肺癌分子標(biāo)志研究的熱點(diǎn)。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)，miRNAs 有各自特異性的血清表達(dá)。與對照組相比，肺癌患者的血清有 28 種miRNAs 缺失，另有 63 種miRNAs是正常人血清中沒有的；其中，miR-206、miR-335和miR-205等 8 種血清miRNAs是肺癌特異性表達(dá)的。

在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA的表達(dá)譜會發(fā)生改變，而血漿中的ec-miRNA 含量卻十分豐富[29-30]，這提示血漿檢測 miRNA 更具可行性；此外，miRNA 以一個(gè)被保護(hù)的狀態(tài)存在于血漿中，因此它可以直接從血漿中被檢測出來[31]；同時(shí)，血漿內(nèi)生 miRNA的穩(wěn)定性使其作為非小細(xì)胞肺癌早期檢測診斷的工具成為可能。時(shí)至今日，顯著高表達(dá)的miR-25和miR-223 已用定量 PCR 技術(shù)在肺癌患者的血清中得到了驗(yàn)證[32]；let-7a 在NSCLC 患者全血中表達(dá)降低，可作為肺癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志[33]；Log-rank 檢驗(yàn)和Cox 回歸分析表明，血清中 miR-183 家族的表達(dá)水平可作為肺癌診斷的潛在標(biāo)志物[34]。

另外，聯(lián)合檢測兩種或兩種以上腫瘤標(biāo)志物可提高診斷及預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。Zheng等[35]的研究結(jié)果說明，聯(lián)合檢測 miR-155、miR-197和miR-182 可作為肺癌早期診斷的非侵害性分子標(biāo)志物。

目前，大部分 miRNA 表達(dá)譜都從切除的腫瘤組織中獲得，但若不能被外科切除時(shí)，通過組織 miRNA 獲得腫瘤信息會有很大的局限性[36]。而血漿 miRNA 比腫瘤組織miRNA 更能反映機(jī)體的狀態(tài)，有望作為一種常規(guī)的早期診斷方法，使肺癌能夠早發(fā)現(xiàn)、早治療。

3.2 miRNA 對非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的判斷

多項(xiàng)研究表明，miRNA 在腫瘤組織中的異常表達(dá)與預(yù)后相關(guān)。Takamizawa等[37]證明，let-7 低表達(dá)獨(dú)立于腫瘤分期的預(yù)后因素（hazard ratio=2.17）；肺癌細(xì)胞中 miR-34的顯著下降與NSCLC 術(shù)后低緩解率相關(guān)，同時(shí) miR-21、miR-182、miR-372、miR-137 及miR-221 均能影響肺癌的預(yù)后[38]。另外，血清中高水平 miR-21 與NSCLC 患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[39-40]。王歡等[41]指出，NSCLC組織miR-106a 比正常對照組織表達(dá)上調(diào)，且術(shù)后復(fù)發(fā)者和死亡者的腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于術(shù)后未復(fù)發(fā)和生存者，這說明 miR-106 有可能成為早期 NSCLC 患者的預(yù)后潛在評價(jià)指標(biāo)。此外，Gao等[1]研究指出NSCLC 患者體內(nèi)miR-21的高表達(dá)和miR-181a的低表達(dá)與低生存率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床難以用 TNM 分期相關(guān)，這提示 miRNA的應(yīng)用與NSCLC的預(yù)后有關(guān)。

另有文獻(xiàn)證明，NSCLC 腫瘤切除后，miRNA 在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平在術(shù)后顯著升高[42]，這也為聯(lián)合檢測血漿 miRNA 判斷預(yù)后創(chuàng)造了條件。

4 miRNA 對非小細(xì)胞肺癌的治療作用

在肺癌的治療層面，miRNA 有著重要的應(yīng)用。目前可確定的對肺癌起原癌基因影響作用的miRNA 有miR-34a、miR-21、miR-155、miR-106a和miR-17-3p，起抑癌基因影響作用的有 let-7、miR-126*、miR-145、miR-451、miR-124a-3和miR-29b-2[43]。

4.1 影響肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲

當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子大于抑制因子作用時(shí)，極有可能發(fā)生腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有研究表明，miR-21 抑制劑可以明顯增加 NSCLC 細(xì)胞內(nèi) PTEN蛋白的水平，進(jìn)而抑制 NSCLC的進(jìn)一步惡化和轉(zhuǎn)移[44]。11q23-24 雜合型缺失（loss of heterozygosity，LOH）的微小區(qū)域含有 miR-125b-1 編碼序列，該區(qū)域在肺癌中存在突變或缺失。目前已報(bào)道，miR-125b-1 基因突變與肺癌患者的臨床病理特征相關(guān)，且該基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間亦存在正相關(guān)，表明miR-125b-1 功能異常能增加患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)性，從而可能在肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[45]。let-7 可以調(diào)控 HMGA2 基因的表達(dá)，而 HMGA2蛋白是一種高遷移率組A蛋白，在90% 以上的肺癌中都有表達(dá)，而且與肺癌患者的存活率成負(fù)相關(guān)。因此，let-7 可通過 HMGA2這一靶基因去調(diào)控肺癌細(xì)胞的遷移能力[46]。另有研究證明，miR-183、miR-125a-5p、miR-1等可以抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[47-48]。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。通過 EMT，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性以及與基底膜連接等上皮表型，獲得了具有較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)等能力的間質(zhì)表型[49]。下調(diào) miR-200c、miR-29a的表達(dá)可促進(jìn) EMT 發(fā)生，提高腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[50-51]；而上調(diào) miR-101的表達(dá)則可通過影響相應(yīng)基因從而抑制 EMT的發(fā)生[52-53]。另外，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429）及miR-205 都是通過抑制 ZEB1（zinc finger E-box binding，dEF-1/TCF8/ZFHX1A）和ZEB2 （SIP1/ZFHX1B）表達(dá)而抑制 EMT的[54-55]。

4.2 誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡

miRNA 通過不完全或完全配對靶向 mRNA的3'UTR 區(qū)堿基，并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶 mRNA的降解和（或）抑制翻譯過程而發(fā)揮抗凋亡基因的作用，使細(xì)胞經(jīng)免疫逃避而具有無限增殖的潛能，發(fā)展為腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)已證明，let-7 在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)可以改變細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，降低腫瘤細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)腫瘤凋亡[56]；Elyakim等[57]指出，miR-191 在肝細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制 miR-191可以減緩細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這在老鼠模型中有減小癌腫體積的作用，但該文尚未涉及臨床試驗(yàn)，亦未將結(jié)論推及肺癌。Chan等[58]研究也發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，miRNA-21在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，而反義miRNA-21能夠誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株半胱天冬氨酸酶增加，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，但該文亦未將試驗(yàn)結(jié)果拓展至 NSCLC。

另有研究[59]指出，miR-223 通過對其靶基因的調(diào)節(jié)去調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而參與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，也有證據(jù)說明 miR-223 在一些腫瘤如肺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)。究竟文獻(xiàn)中已經(jīng)證明的miRNA 對腫瘤細(xì)胞凋亡起到調(diào)節(jié)作用的結(jié)論是否在NSCLC 中依然成立，仍舊是未知之謎，需要今后的研究去進(jìn)一步證實(shí)。

4.3 與順鉑化療藥物聯(lián)合使用

順鉑（cisplatin，DDP）是非小細(xì)胞肺癌化療的一線藥物，但其獲得性耐藥制約了療效的發(fā)揮。陸曉等[60]運(yùn)用RT-PCR 檢測芯片表達(dá)法，通過對 A549/DDP和A549 中miRNAs 表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以 A549 細(xì)胞株為對照組，得到 34 條有差異表達(dá)的miRNA：其中耐藥株 A549/DDP中上調(diào)的miRNA 有 19 條，下調(diào)的miRNA 有 15 條。這些 miRNA 可能在非小細(xì)胞肺癌對 DDP 耐藥性上發(fā)揮重要作用。Galluzzi等[61]也發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 細(xì)胞中，pre-miR181a和pre-miR-630 可分別增強(qiáng)或減弱順鉑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。它們可同步調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡內(nèi)在通路的線粒體和線粒體后階段，包括 Bax 低聚反應(yīng)、線粒體跨膜電位的消失以及caspase-9和caspase-3蛋白分解作用的完成。李有杰等[62]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bcl-2 在DDP 作用后表達(dá)下調(diào)，提示 miR-16 負(fù)調(diào)節(jié) Bcl-2的表達(dá)參與了 DDP 對 A549 細(xì)胞化療過程。miRNA的應(yīng)用可能會對 NSCLC的治療有所促進(jìn)。

2012年，Zheng等[63]和Yang等[64]分別在肝癌和膠質(zhì)瘤中證明了 miR-136、miR-376a 可以配合順鉑聯(lián)合治療，加強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。此外，Du等[65]體外研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞 miRNA 與化療耐藥相關(guān)，通過調(diào)節(jié)microtubule-associated protein kinases等耐藥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，改善腫瘤對藥物的敏感性，該機(jī)制可以作為化療耐藥預(yù)測及調(diào)節(jié)手段進(jìn)一步研究。另外，由于不同 miRNA的作用靶點(diǎn)及其功能略有差異，多種miRNA 聯(lián)合應(yīng)用亦可能會起到更好的臨床效果。

5 小結(jié)

綜上所述，miRNA 通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳學(xué)調(diào)控和miRNA 自身的表達(dá)調(diào)控等三種機(jī)制參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展。外周血清學(xué)檢測 miRNA 為NSCLC的早期診斷及預(yù)后判斷提供了標(biāo)準(zhǔn)。此外，它在影響肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、與現(xiàn)有抗腫瘤藥聯(lián)合用藥等方面亦為NSCLC的早期診斷、治療、預(yù)后判斷開辟了新方向。然而，目前單獨(dú)研究 miRNA 在NSCLC 中發(fā)生發(fā)展機(jī)制的課題數(shù)量甚少，大部分 miRNA 對于肺癌的臨床作用都是從其他癌癥，例如肝癌、乳腺癌等，類推至肺癌的，缺乏直接的理論依據(jù)，甚至有部分陽性結(jié)果在肺癌中是完全陰性的，故其研究結(jié)果的可行性和真實(shí)性有待改善。另外，雖然 NSCLC 發(fā)病率和死亡率都很高，但可供臨床研究和應(yīng)用選擇的miRNA 數(shù)量仍舊偏少，說明本方面依然需要加大科研力度。

由于miRNA 本身亦可能成為抗腫瘤或抗腫瘤并發(fā)癥藥物的靶點(diǎn)，而現(xiàn)階段尚無任何此類文獻(xiàn)報(bào)道；再加上此法雖能提示 NSCLC的組織學(xué)分型，卻難以區(qū)別原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌，因此絕大多數(shù)研究成果距實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)距離。

此外，目前文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于與NSCLC 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA的抽提、定量、測試等研究方法不盡相同，導(dǎo)致 miRNA 實(shí)際大規(guī)模應(yīng)用于臨床的可操作性偏小。因此，在后續(xù)研究中希望可以找出合適而統(tǒng)一的內(nèi)參基因作為對照，并建立起使用 miRNA 對非小細(xì)胞肺癌診斷、治療、預(yù)后判斷的標(biāo)準(zhǔn)化程序，促進(jìn) miRNA 在實(shí)際臨床中的推廣應(yīng)用。

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