李浩強，蔡潔行，張玉彬

單克隆抗體（MAbs）具有高度的特異性，因而被大量用于各種疾病尤其是癌癥和自身免疫性疾病的治療。2009年，包含生物抗體藥物在內(nèi)的重組蛋白獲得了 990 億美元的市場銷售額[1]，最突出的重磅炸彈級藥物包括：美羅華利妥昔單抗（rituximab，美國 Genentech和Biogen Idec公司研制）、赫賽汀曲妥珠單抗（trastuzumab，美國 Genentech公司研制）、阿伐斯汀貝伐單抗（bevacizumab，美國 Genentech公司研制）、艾比特思西妥昔單抗（cetuximab，美國 ImClone公司和Bristol-Myers Squibb公司研制）和修美樂阿達木單抗（adalimumab，美國 Cambridge 抗體公司和Abbott公司研制）等。表1 為2011年部分單克隆抗體藥物的全球銷售情況[2]。以上抗體均由大規(guī)模培養(yǎng)的經(jīng)過基因改造的宿主細胞（host cell）來生產(chǎn)表達。對于治療性抗體而言，為了滿足其生物活性，需要進行正確的折疊和翻譯后修飾，因此用于生產(chǎn)治療性抗體的宿主細胞往往是哺乳動物細胞，主要包括：Sp2/0 骨髓瘤細胞、NS0 小鼠骨髓瘤細胞、HEK293人胚胎腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO），其中以 CHO 細胞用途最為廣泛。

1 CHO 細胞

目前，70% 以上的抗體蛋白是由 CHO 細胞生產(chǎn)的[3]。用于治療性抗體表達的CHO 細胞是 1957年由 Tjio和Puck[4]將原代培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細胞永生化獲得的，其中包括 DUXB11、DG44和CHOK1 細胞株。其中，DUXB11和DG44 細胞不具有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）活性，需要甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶（glycine、hypoxanthine and thymidine，GHT）作為生長補充原料，而 CHOK1 則相反。雖然 CHO 細胞最初是為了便于體外的基礎(chǔ)生物醫(yī)學研究而不是為了用于重組蛋白表達，但 DHFR 缺陷的CHO 細胞易于制作穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細胞株。采用外源 DHFR 與目的基因共轉(zhuǎn)染，通過去掉GHT的培養(yǎng)基可以篩選到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，這已成為一項標準的遺傳篩選方法。

對比其他哺乳動物細胞，CHO 細胞的優(yōu)點主要包括：① CHO 細胞能夠?qū)Φ鞍走M行糖基化，并且其糖型與人類基本一致；② CHO 細胞能夠在生物反應(yīng)器培養(yǎng)的過程中獲得較高的細胞密度；③ CHO 細胞不易傳播人類的病毒；④CHO 細胞相比其他生產(chǎn)用哺乳動物細胞基因組更容易進行改造和擴增；⑤ CHO 細胞與別的生產(chǎn)用哺乳動物細胞類似，容易進行外源基因的轉(zhuǎn)染和表達；⑥ CHO 細胞已經(jīng)廣泛運用于蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)染和篩選特性已經(jīng)被人們所熟知[5]。

2 表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

生產(chǎn)用穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建首先由表達載體的構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染開始（圖 1）。將表達抗體的目的基因構(gòu)建到載體上，再將該載體轉(zhuǎn)染進入宿主細胞內(nèi)。常見的轉(zhuǎn)染方式主要有磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。DNA 進入宿主細胞核后將會隨機整合到宿主細胞基因組當中去，因此表達水平與基因拷貝數(shù)、基因整合位點的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。然后，不同篩選試劑將被用于篩選能夠正確表達目的基因并且高水平表達的細胞池。由于此時得到的細胞池中的每個細胞特性各異，具有不同的基因整合位點、拷貝數(shù)、細胞單產(chǎn)和生長速率，因此需要將其中具有高產(chǎn)、穩(wěn)定表達特性的細胞個體分離出來分別培養(yǎng)，通常需要獲得數(shù)百甚至上千的候選克隆供進一步篩選。被篩選出來的克隆經(jīng)過傳代培養(yǎng)和分批補料（fed-batch）實驗，比較其生長特性、代謝狀況、表達量高低、表達產(chǎn)物質(zhì)量等因素，選出最優(yōu)的幾個克隆進入生物反應(yīng)器放大實驗，最終確定生產(chǎn)用單克隆細胞株。

表1 2011年部分單克隆抗體全球銷售情況

圖1 細胞株構(gòu)建基本流程

人工構(gòu)建的哺乳動物表達載體一般為穿梭載體，含有原核基因序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因等，這樣便于載體在原核細胞中擴增和大量制備；另外含有能使外源基因在哺乳動物細胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元件，以及終止子和PolyA 序列。為了在轉(zhuǎn)染后有效地篩選出高表達的細胞，表達載體上除了包含抗體的重鏈、輕鏈以外，往往還含有各種篩選標記，不同的篩選標記一般可以被分為兩大類：一類是以 G418（新霉素）為代表的抗生素類篩選標記，另一類是以甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）為代表的影響細胞代謝的篩選標記。與此同時，高效的啟動子（如 CMV[6]）和延長因子（如 EF1α[7]）被廣泛運用于抗體表達載體。翻譯的起始位置是恒定的Kozak 序列[8]：GCC GCC（A/C）CC和抗體特異性的信號肽——不同的重鏈、輕鏈類型有各自特異的信號肽序列[9]。表 2 為常用篩選標記及篩選試劑。

表2 哺乳動物表達系統(tǒng)常用篩選標記及篩選試劑

Life Technologies公司的PcDNA3.3/Poptivec 載體系統(tǒng)是常用的商業(yè)化載體系統(tǒng)，具有原生巨細胞病毒（CMV）啟動子/增強子序列，能有效促進目的基因表達，其中PcDNA3.3 含有 G418 抗性基因，Poptivec 含有 DHFR 基因，適用于DHFR 缺陷的細胞。另外，該公司開發(fā)的PCHO1.0 載體系統(tǒng)包含兩個不同強度的CMV 啟動子、DHFR 基因和嘌呤霉素抗性基因，能夠?qū)⒖贵w的重鏈和輕鏈構(gòu)建在同一個載體上進行轉(zhuǎn)染表達，適用于該公司開發(fā)的CHO-STM細胞。

為了得到穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞株，往往使用 MTX 或者氨基亞砜蛋氨酸（methionine sulfoximine，MSX）進行篩選擴增[10]，據(jù)相關(guān)文獻報道，同時使用 MTX和MSX 可以顯著提高篩選的效果[11]。

MTX是 DHFR的特異性抑制劑。當宿主細胞是DHFR－，如 CHO-DG44，當轉(zhuǎn)染的載體上含有 DHFR 基因時，MTX能夠促使細胞增加包含 DHFR 基因和目標蛋白基因在內(nèi)的基因拷貝數(shù)。通過不斷增加 MTX的濃度可以逐步增加拷貝數(shù)，直到到達“瓶頸”，即隨著 MTX 濃度的增加，拷貝數(shù)不發(fā)生明顯改變。在載體構(gòu)建的過程中，可以使用較弱的啟動子來弱化 DHFR 基因的表達或者改造DHFR的基因使之不穩(wěn)定，從而增加 MTX的篩選擴增效果[12]。

MSX是一種跟 MTX 類似的代謝類抑制劑，它能夠特異性抑制谷氨酸合成酶（glutamine synthetase，GS）。對比DHFR 篩選系統(tǒng)，GS 較少用于單抗的表達生產(chǎn)，其主要原因是有實驗表明 GS 系統(tǒng)較為不穩(wěn)定，即隨著細胞的培養(yǎng)時間的延長，其表達量出現(xiàn)了明顯的下降。由于實際生產(chǎn)用穩(wěn)定細胞株一般要求經(jīng)過 12周的穩(wěn)定性實驗，表達量的下降應(yīng)小于30%，故 DHFR 系統(tǒng)在生物制藥工業(yè)最為廣泛使用。

插入染色體的位置影響真核基因的表達，即“位置效應(yīng)”。當外源基因插入異染色質(zhì)及其附近區(qū)域產(chǎn)生位置效應(yīng)時，此處異染色質(zhì)區(qū)域?qū)a(chǎn)生位置效應(yīng)斑點，此時，周圍的異染色質(zhì)將有效地阻止插入基因的表達。為了克服“位置效應(yīng)”，一般有兩種辦法：①將目的基因定點整合到合適的位點；②在目的基因的側(cè)翼加上“絕緣子”DNA 序列，從而抑制“位置效應(yīng)”。

在CHO 細胞中，含有核骨架依附區(qū)以及核基質(zhì)依附區(qū)（S/MAR）的DNA 序列能夠保護目的基因不被周圍的染色質(zhì)所影響[13]。有研究表明，S/MAR能夠減少不同克隆之間表達的差異性[14-15]。同時，也有數(shù)據(jù)指出，當載體中含有 MAR 元件時，目的基因的表達量可以提高 10 倍[16]。

3 高表達細胞株的篩選

篩選高表達單克隆細胞株是細胞株構(gòu)建的關(guān)鍵步驟，衡量標準包括抗體表達量、產(chǎn)品質(zhì)量、代謝穩(wěn)定性、細胞穩(wěn)定性等。當目的基因被轉(zhuǎn)染到宿主細胞內(nèi)，并按照一定的細胞密度在合適的篩選壓力下進行傳代培養(yǎng)后便得到了細胞池。細胞池的表達量取決于轉(zhuǎn)染的方式、篩選壓力的作用以及目的基因整合情況。由于目的基因整合具有很大的隨機性，即使使用相同的方法進行轉(zhuǎn)染和篩選，表達量依然會體現(xiàn)出極大的差異性[17]，接下來就要從細胞池中篩選出高產(chǎn)穩(wěn)定的細胞株。

常用的篩選克隆的方法包括：有限稀釋法（limiting dilution cloning，LDC）、流式細胞儀分選法（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）、半固體培養(yǎng)基篩選法等。其中有限稀釋法因為其低成本和易于操作，曾廣泛運用于克隆的篩選。該法是將細胞稀釋到極低的細胞密度，并將稀釋好的細胞置于96 孔板中培養(yǎng)，使孔板中每個孔的理論細胞數(shù)小于1個，稀釋后使用顯微鏡對 96 孔板整板拍照，以確保單克隆。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后使用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)選取表達量高的細胞擴大培養(yǎng)。有限稀釋法往往需要重復(fù)兩次，以確保單克隆細胞株的純度。由于有限稀釋法實驗量大、實驗周期長、實驗效率低，已經(jīng)被逐步淘汰?，F(xiàn)代企業(yè)常使用半固體培養(yǎng)基法進行單克隆的篩選[18]。細胞生長在半固體培養(yǎng)中，形成單克隆細胞團，同時將抗體分泌在細胞團周圍，半固體培養(yǎng)基中含有熒光標記的二抗，能與抗體 Fc 片段特異性結(jié)合，當用一定波長的光進行激發(fā)時就能發(fā)出熒光（圖 2）[19]。使用圖像分析軟件能夠?qū)慰寺〖毎麍F的大小、熒光強度進行測定，從而篩選出生長旺盛、表達量高的單克隆細胞團。自動化的機械臂能夠按照實驗人員設(shè)定的參數(shù)將符合要求的細胞團挑取出來用于后續(xù)的擴大培養(yǎng)。半固體培養(yǎng)基法能夠通過自動化的方式挑取單克隆細胞，大大減輕了實驗人員的工作負擔，但用于熒光掃描、圖像分析和克隆挑取的機器價格昂貴，同時在半固體培養(yǎng)基中由單個細胞長成具有明顯抗體分泌的細胞團需要 2～3周時間，耗時較長。

圖2 半固體培養(yǎng)基克隆熒光

另一種開始廣泛使用的方法是流式細胞儀分選法。將帶有熒光標記的二抗和分泌抗體的CHO 細胞混合孵育，分泌到細胞表面的抗體就能夠被流式細胞儀檢測到，從而利用其分選功能篩選出分泌多的細胞[20]。為了使分泌到胞外的抗體能夠維持在細胞膜表面，還可以使用微囊將細胞以及分泌的抗體包裹起來。目前，又有新的方法運用于流式細胞儀分選，即將綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的兩個基因片段作為報告基因分別構(gòu)建到抗體重鏈和輕鏈的表達載體上進行共轉(zhuǎn)染[21]，當這兩個片段都整合到細胞內(nèi)進行表達時，能夠產(chǎn)生綠色熒光蛋白而發(fā)出綠色熒光，利用 FACS 進行分選得到高表達的細胞。使用該方法在轉(zhuǎn)染完成后48 h 就能夠進行檢測，可以有效縮短克隆篩選的時間，提高實驗效率。

4 細胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化

在獲得單克隆細胞株后，還需要對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以達到更高的表達量和合乎規(guī)定的產(chǎn)品質(zhì)量。經(jīng)過二十多年的發(fā)展，化學成分明確的培養(yǎng)基（chemically defined media，CD media）已經(jīng)大規(guī)模運用于細胞培養(yǎng)和抗體的生產(chǎn)表達。常用的細胞培養(yǎng)基一般含有氨基酸、維生素、無機鹽、糖、脂質(zhì)體和生長因子等[22]。在普通的CD 培養(yǎng)基中細胞通常不能達到較高的細胞密度和活率，因此往往在分批補料培養(yǎng)過程中加入適量的非動物源的水解物[23]，這些水解物由蛋白水解產(chǎn)生，包括氨基酸、短肽、碳水化合物、維生素和無機鹽等，能夠補充細胞生長和抗體表達所需的營養(yǎng)。

為了對基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補料進行優(yōu)化，需要對細胞的代謝進行分析研究，例如通過保持較低的糖濃度來抑制乳酸的產(chǎn)生，降低谷氨酰胺的濃度來減少銨離子的累積。乳酸是細胞代謝中的重要代謝產(chǎn)物之一，一直以來人們認為高水平的乳酸含量會對細胞產(chǎn)生明顯的毒害作用，因此大量的實驗被用于降低乳酸含量或者促進細胞對乳酸的消耗。Genentech公司的科研人員嘗試將丙酮酸和乳酸作為細胞培養(yǎng)的碳源，并使用乳酸取代 CO2來調(diào)節(jié) pH 值，顯著降低了細胞培養(yǎng)過程中銨離子的濃度和pCO2，而在細胞培養(yǎng)的過程中，其生長狀況和表達量與對照組基本一致[24]。

培養(yǎng)基不僅影響細胞生長，還對表達的抗體的質(zhì)量有著較大影響，如抗體蛋白的糖基化形式、抗體蛋白的酸堿峰分布等，實驗設(shè)計（design of experiment，DOE）[25]被廣泛運用，同時為了達到節(jié)省人力和時間的目的，高通量的實驗方法被越來越多地采用。例如 Amgen公司的研究人員采用深孔 24 孔板，每孔可容納 1～3ml 細胞[26]。另一種高通量篩選系統(tǒng)是 SimCell[27]，一種由 Bioprocess公司開發(fā)的用于分批補料培養(yǎng)的微型生物反應(yīng)器，該微型反應(yīng)器能夠?qū)崟r檢測活細胞密度、活率、pH 值和溶解氧，每個微型反應(yīng)器的體積約為700 μl，可同時進行上千個實驗。

當前，以 Amgen、Genentech公司為代表的生物制藥巨頭所使用的細胞株的蛋白表達量已達到 5～10 g/L，Pfizer、MedImmune公司的個別細胞株甚至超過了 10 g/L。因此，細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器也從過去的大型化（20 kl）向小型化（1 kl）、連續(xù)性、一次性轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的不銹鋼反應(yīng)器在使用前需要進行徹底的清潔滅菌，而且有著更大的污染的風險，而一次性反應(yīng)器可以大大節(jié)省準備的時間。帶有攪拌器的袋式生物反應(yīng)器，如 Hyclone公司的SUB、Sartorius公司的BIOSTAT和Xcellerex公司的XDR-DSTB，正越來越多地被運用于治療性抗體的生產(chǎn)[28]。

5 結(jié)語

哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)新和相關(guān)設(shè)備的發(fā)展會不斷提高哺乳動物細胞培養(yǎng)的效率，縮短細胞株構(gòu)建的時間，更易于獲得高產(chǎn)穩(wěn)定的單克隆抗體細胞株，從而推動生物制藥行業(yè)的進步?？梢灶A(yù)見，在未來的5～10年里，產(chǎn)量大于10 g/L的細胞株將更多地投入到生產(chǎn)中去。

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