李雪冰 綜述 尤嘉琮 周清華 審校

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的腫瘤。全球每年大約有160萬(wàn)的肺癌新發(fā)病例和140萬(wàn)的肺癌死亡病例[1]。在美國(guó)肺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第2位，而死亡率列第1位[2]。根據(jù)衛(wèi)生部2012年度腫瘤登記年報(bào)資料[3]顯示，我國(guó)2009年肺癌發(fā)病率為53.57/10萬(wàn)，死亡率為45.57/10萬(wàn)，即每年新發(fā)肺癌患者超過70萬(wàn)，死亡超過60萬(wàn)。

已有的研究[4,5]表明，肺癌發(fā)病原因與多種基因的突變密切相關(guān)，其中最為重要和典型的是抑癌基因p53的突變和原癌基因K-ras的突變。此外，約有40%-50%的肺腺癌中存在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的異常高表達(dá)或激活突變，并且與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)[6,7]。與非吸煙人群相比，p53和K-ras的突變比例在吸煙人群中略高；而EGFR的突變比例在非吸煙人群中遠(yuǎn)高于吸煙人群[8]。因此，以這些基因作為靶點(diǎn)尋找治療肺癌的方法具有很強(qiáng)的可行性。此外，還有一種重要的腫瘤微環(huán)境因素-低氧（hypoxia），對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。因此，本文將近年來低氧與肺癌相關(guān)性的研究進(jìn)展綜述如下。

1 低氧的概念

腫瘤是非單一細(xì)胞的實(shí)體，從總體上看包括腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)，而間質(zhì)又主要包括血管、淋巴管、結(jié)締組織、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等。此外，可溶性分子O2還參與腫瘤細(xì)胞附近的間質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，促進(jìn)腫瘤的惡性化[9]，他們共同組成了腫瘤的微環(huán)境。機(jī)體各組織器官的氧分壓明顯低于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓160 mmHg，且各器官并不同，其中由高到低分別為：肺110 mmHg，脾66 mmHg，心25 mmHg，腎25 mmHg，腦24 mmHg，肝24 mmHg[10]。低氧是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態(tài)，這種狀態(tài)會(huì)限制甚至終止器官、組織和細(xì)胞的生理功能[11]。低氧可以由多種因素造成[11]，而低氧常發(fā)生在急慢性血管性疾病、肺部疾病和腫瘤中[12]。

2 肺癌低氧微環(huán)境的發(fā)現(xiàn)

其實(shí)，早在50多年前，Thomlinson和Gray[13]就在距血管180 μm的地方觀察到了腫瘤壞死，他們推測(cè)這是腫瘤細(xì)胞過度增殖使其將血氧完全耗盡的位置，這是人類首次開創(chuàng)性地觀測(cè)并推斷了腫瘤低氧微環(huán)境的存在。此后，H?ckel等[14]也利用氧電極在頭頸部、頸椎腫瘤和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了低氧存在，并且與腫瘤患者的低存活率和腫瘤的高轉(zhuǎn)移性均具有相關(guān)性。后續(xù)的研究[15]發(fā)現(xiàn)，放療過程中氧氣可以被激發(fā)而產(chǎn)生自由基，殺傷腫瘤細(xì)胞，但處于低氧區(qū)的腫瘤細(xì)胞由于缺乏氧氣，自由基產(chǎn)生較少，從而對(duì)放療產(chǎn)生抵抗作用。直到2006年，Le等[16]才在肺癌患者體內(nèi)檢測(cè)到了肺癌組織低氧氣分壓的存在，并且與較差的預(yù)后相關(guān)，這是迄今為止唯一關(guān)于檢測(cè)到肺癌組織低氧的報(bào)道。

3 低氧的信號(hào)通路

隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)低氧會(huì)通過一個(gè)能夠感受并應(yīng)對(duì)低氧的重要轉(zhuǎn)錄因子-低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF），對(duì)腫瘤產(chǎn)生多方面的影響。HIF是由Semenza等[17]在研究低氧加速紅細(xì)胞成熟時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它是一個(gè)由受氧調(diào)節(jié)的α亞基與穩(wěn)定表達(dá)的β亞基組成的異源二聚體。在常氧條件下，HIF-α蛋白上兩個(gè)關(guān)鍵位置的脯氨酸會(huì)被脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain,PHD）羥化，使其可被希佩爾·林道病基因產(chǎn)物（product of von Hippel-Lindau gene, pVHL）識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而被pVHL降解復(fù)合物泛素化降解；而在低氧條件下，PHD活性受到抑制，HIF-α無(wú)法被羥基化，從而無(wú)法被pVHL識(shí)別、結(jié)合并介導(dǎo)降解，HIF-α便會(huì)大量積累，結(jié)合HIF-1β，入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，在腫瘤的血管生成、細(xì)胞生存、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和代謝等方面發(fā)揮重要的作用。而在2009年HIF也被發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中轉(zhuǎn)錄水平上高表達(dá)，并且與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)[18]。此后，越來越多的研究[19]證明低氧和HIF有可能成為治療肺癌的一個(gè)十分重要的靶點(diǎn)。

4 低氧信號(hào)通路對(duì)肺癌的作用

低氧可以通過減少自由基產(chǎn)生，從而對(duì)肺癌的放療產(chǎn)生抵抗作用。而低氧對(duì)肺癌的影響遠(yuǎn)不止這些，Minakata等[20]發(fā)現(xiàn)在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌中，低氧可以通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor alpha, TGF-α）來激活野生型EGFR，從而使肺癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)吉非替尼的耐藥性；Ouyang等[21]還發(fā)現(xiàn)低氧可以上調(diào)骨膜蛋白（periostin）的表達(dá)，通過激酶Akt/PKB信號(hào)通路提高肺癌細(xì)胞的生存能力。其實(shí)，低氧相關(guān)信號(hào)分子如低氧誘導(dǎo)因子HIF、脯氨酸羥化酶PHD和希佩爾·林道病基因產(chǎn)物pVHL均會(huì)通過多條途徑對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響而發(fā)揮更加重要的作用。

4.1 HIF對(duì)肺癌的作用 HIF由α和β兩個(gè)亞基組成。在哺乳動(dòng)物中，HIF-α存在三種亞型，HIF-1α和HIF-2α在結(jié)構(gòu)和功能上相似性較大，而HIF-3α研究較少，有報(bào)道[22]認(rèn)為它可能作為HIF-1α和HIF-2α的負(fù)調(diào)控元件。HIF-1α在幾乎所有類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，而HIF-2α和HIF-3α的表達(dá)則具有一定的組織局限性[23]。研究表明，低氧可以通過HIF-1α或HIF-2α對(duì)肺癌產(chǎn)生重要影響。

4.1.1 HIF在肺癌組織中高表達(dá) 早在1999年Zhong等[24]通過大量的免疫組化染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在19種腫瘤的13種中呈現(xiàn)高表達(dá)，其中包括肺癌。2000年Volm等[25]在96例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中對(duì)HIF-1α和HIF-1β進(jìn)行了免疫組化染色，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1陽(yáng)性患者的平均存活時(shí)間明顯高于HIF-1陰性患者，提示與較好的預(yù)后有關(guān)聯(lián)。2001年Giatromanolaki等[26]應(yīng)用免疫組化染色對(duì)HIF-1α或HIF-2α進(jìn)行的檢測(cè)，結(jié)果顯示二者分別在62%和50%的非小細(xì)胞肺癌病例中高表達(dá)，并且與多種血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)呈正相關(guān)。但與之前的報(bào)道相反，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1α與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。2009年Yohena等[18]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR手段在肺癌組織中發(fā)現(xiàn)了HIF-1α在轉(zhuǎn)錄水平上的高表達(dá)，這與之前報(bào)道的蛋白水平結(jié)果相一致，同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)HIF-1α與較差的預(yù)后密切相關(guān)。

4.1.2 HIF對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 2006年Zhang等[27]在肺腺癌A549細(xì)胞中外源性地表達(dá)了HIF-1α，他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比表達(dá)HIF-1α的A549細(xì)胞可以通過上調(diào)多藥耐藥基因MDR-1，抵抗由5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Kamlah等[28]在LLC1肺腺癌模型小鼠中，利用頸靜脈siRNA注射技術(shù)，同時(shí)沉默HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行基因沉默的肺癌模型小鼠存活時(shí)間明顯增長(zhǎng)，并且免疫組化顯示腫瘤的增殖明顯減慢，血管生成和凋亡也都明顯減少。同年，Chen等[29]從大量的非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了HIF-1α與凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成員蛋白survivin表達(dá)的正相關(guān)性，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)survivin的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。HIF-1α在小細(xì)胞肺癌中的作用是由Wan等[30]報(bào)道，他們通過直接低氧、基因過表達(dá)和基因沉默三種手段改變HIF-1α的表達(dá)，并進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以促進(jìn)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS1）基因的表達(dá)，而SOCS1可以促進(jìn)小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞的凋亡并抑制其生長(zhǎng)。這一結(jié)果首次揭示了HIF-1α在小細(xì)胞肺癌中的特殊調(diào)節(jié)機(jī)制，即通過SOCS1基因?qū)ψ陨淼拇侔┳饔眠M(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。Mazumdar等[31]也利用K-ras（G12D）肺癌小鼠模型，揭示了HIF-2α的兩面作用，他們提出HIF-2α不僅能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)展，還能通過調(diào)節(jié)抑癌基因，發(fā)揮抑制肺癌的作用。以上這些報(bào)道表明，HIF在低氧加速肺癌進(jìn)程的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。

4.1.3 HIF在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 2007年Shyu等[32]在利用不同侵襲能力的配對(duì)肺癌細(xì)胞系CL1和CL1-5研究HIF-1α的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α僅在高侵襲能力的CL1-5細(xì)胞系中表達(dá)，并且沉默HIF-1α表達(dá)后可以明顯降低其侵襲能力。深入的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）MMP1和MMP2的表達(dá)來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲。Li等[33]在2009年利用94例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α、HIF-2α與CC趨化因子受體7（CC chemokine receptor 7,CCR7）的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性，而深入的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α和HIF-2α可以正向調(diào)節(jié)CCR7的表達(dá)，而CCR7又可以通過促進(jìn)激酶ERK的磷酸化來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移。2010年Jacoby等[34]利用兩株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型和兩株小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型，在裸鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用HIF-1α的拮抗劑PX-478對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理，可以明顯抑制原位腫瘤的生長(zhǎng)和縱隔轉(zhuǎn)移，并與較好的預(yù)后相關(guān)。以上研究結(jié)果均表明，低氧可以通過HIF促進(jìn)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移，從而影響肺癌的預(yù)后。

4.2 PHD在肺癌中的作用 脯氨酸羥化酶PHD家族有PHD1、PHD2和PHD3三個(gè)成員，在低氧和常氧條件下發(fā)揮降低抑癌蛋白HIF的作用。2006年Davidson等[35]在肺腺癌A549細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，可溶性的鎳可以抑制PHD的羥化功能以及PHD與HIF的作用，從而穩(wěn)定了HIF，此項(xiàng)研究開創(chuàng)性地提出PHD可以作為肺癌治療的靶點(diǎn)。2008年Giatromanolaki等[36]利用73例非小細(xì)胞肺癌患者標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中的33例標(biāo)本具有高HIF/PHD表達(dá)，而只有18例標(biāo)本具有低的HIF/PHD表達(dá)，這一結(jié)果在臨床標(biāo)本水平提示了HIF的促癌作用和PHD的抑癌作用。2001年Chen等[37]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)HIF的關(guān)鍵分子脯氨酸羥化酶PHD1、PHD2和PHD3均在62例配對(duì)非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本的癌組織中高表達(dá)。通過與臨床資料和病理結(jié)果的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PHD3的高表達(dá)與腫瘤分期較早及分化相關(guān)，通過病理切片染色還發(fā)現(xiàn)PHD3的高表達(dá)與抗凋亡蛋白Bcl-2呈負(fù)相關(guān)。這一報(bào)道提示在非小細(xì)胞肺癌中PHD3可能具有潛在的促凋亡功能。2011年Andersen等[38]擴(kuò)大了樣本量，他們利用335例I期到III期的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本進(jìn)行組織芯片和免疫組化染色實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了三種脯氨酸羥化酶的表達(dá)情況，并分析與預(yù)后的關(guān)系。研究結(jié)果顯示PHD1、PHD2和PHD3在肺癌標(biāo)本中均高表達(dá)，并且與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)，具有高表達(dá)PHD的病例5年存活率明顯低于低表達(dá)組。這一結(jié)果提示脯氨酸羥化酶也可能具有促癌作用。在2012年最新的一項(xiàng)研究中，Chen等[39]應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組化染色技術(shù)，在26例肺癌標(biāo)本中檢測(cè)了HIF及三種脯氨酸羥化酶的表達(dá)情況，其中12例病例伴有慢性阻塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease, COPD），而其余14例為對(duì)照組。通過醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出結(jié)論，脯氨酸羥化酶通過調(diào)節(jié)HIF，在肺癌病例中參與了COPD的低氧肺血管重建過程。

4.3 pVHL在肺癌中的作用 雖然pVHL被證明可以通過泛素化降解途徑下調(diào)促癌蛋白HIF而發(fā)揮抑癌基因的功能。但是，肺癌方面功能的報(bào)道中卻顯示pVHL存在兩方面作用。1997年Corless等[40]率先通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，pVHL主要在肺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有較強(qiáng)的表達(dá)。2001年Kamada等[41]發(fā)現(xiàn)肺癌H1299細(xì)胞中導(dǎo)入外源表達(dá)的pVHL，可以穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白組織裝配，并通過促進(jìn)黏著斑形成，抑制肺癌細(xì)胞的遷移能力，這是首次發(fā)現(xiàn)pVHL在肺癌細(xì)胞中具有抑癌作用。而最新的研究報(bào)道顯示了pVHL的促癌作用。Zhou等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞A549中穩(wěn)定沉默pVHL表達(dá)可以明顯降低細(xì)胞的成克隆能力和增殖能力，揭示了pVHL同樣可以發(fā)揮促癌作用，并且暗示了非HIF依賴的pVHL新功能。

5 結(jié)語(yǔ)

從腫瘤低氧微環(huán)境最初被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在的60年中，人們已經(jīng)清楚地了解了它的存在、調(diào)節(jié)機(jī)制和意義及功能。越來越多的研究表明，低氧對(duì)各種類型的腫瘤包括肺癌均起到十分重要的作用。低氧誘導(dǎo)因子HIF也已成為肺癌發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)極其重要的調(diào)控因子。HIF在肺癌中的高表達(dá)與增殖和預(yù)后等相關(guān)聯(lián)，使其可以作為肺癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的分子標(biāo)記存在。此外，調(diào)節(jié)HIF的重要分子PHD和pVHL也在肺癌組織細(xì)胞中主要呈現(xiàn)低表達(dá)，并發(fā)揮重要的功能。這使得低氧、低氧誘導(dǎo)因子以及其調(diào)節(jié)分子PHD和pVHL成為十分有潛力的肺癌治療靶點(diǎn)。