李 陽潘 文徐宗香陳 曦劉 宇

（1黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2黑龍江省齊齊哈爾動物醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征的研究進展

李 陽1潘 文2徐宗香1陳 曦1劉 宇1

（1黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2黑龍江省齊齊哈爾動物醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征 （PRRS）俗稱藍耳病，是一種以母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、弱仔和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病，死亡率很高。本文就近年來該病在遺傳變異和病毒感染方面，尤其是免疫學研究的相關進展作一綜述。

豬繁殖與呼吸障礙綜合征；病毒感染；遺傳變異；免疫學研究

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是一種豬的神秘綜合征，由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起，可導致妊娠母豬發(fā)生嚴重繁殖障礙，以及各年齡段豬（尤其是仔豬）的呼吸道疾病發(fā)病率和死亡率升高。1987年首次在美國暴發(fā)，1990年以后開始在歐洲一些國家傳播。根據(jù)抗原性差異，PRRSV可分為北美洲型和歐洲型[1,2]。1996年，郭寶清等[3]首次證實PRRSV在我國豬群中存在，隨后該病在我國呈蔓延趨勢，流行毒株為北美洲型，我國將其列為二類動物疫病。該病目前已遍及全球，造成的經(jīng)濟損失占豬各類傳染病總損失的30%以上[4]，對豬肉食品安全和市場供應構成嚴重威脅。美國農(nóng)業(yè)部的年報稱2000年至今，因PRRS造成的年均經(jīng)濟損失高達6.64億美元。鑒于本病的危害性，本文擬對該病在遺傳變異和病毒感染方面，尤其是免疫學的相關研究進展作一概述。

1 PRRSV的生物學特性

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒歸屬于套式病毒目的動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。在電鏡下觀察，病毒粒子為直徑48～83 nm，平均大小為60～65 nm的球形，核衣殼直徑為25～30 nm，外包被一層脂質(zhì)雙層膜[5]。病毒粒子表面有明顯的纖突，由于囊膜的存在，對溫度、pH和去污劑較敏感。病毒感染性于-70℃下可穩(wěn)定數(shù)月，4℃時7天感染性降到10%，21℃病毒可存活6天，隨著溫度升高，PRRSV可迅速失活。酸堿度也影響病毒活力，pH小于6或大于7.65時其感染性將失活。病毒在氯化銫中的浮密度為1.13～1.19 g/cm3，略低于在蔗糖中的浮密度，用氯化銫梯度離心提純的病毒感染性高于蔗糖提純法。PRRSV有著比較嚴格的生長宿主范圍，在豬體內(nèi)對單核巨噬細胞系統(tǒng)有嗜性，尤其是豬原代肺巨噬細胞（PAM），常用的原代和傳代細胞中均不能生長；在體外，病毒可在MA-104及源于 MA-104的傳代細胞系（Marc-145、CL2621和 CRL11171等）中增殖，但歐洲型在CL2621和Marc-145細胞系上卻不易生長。高致病性PRRSV毒株在Marc-145細胞中適應1～3代即可產(chǎn)生明顯的細胞病變。完整的PRRS病毒粒子沒有血凝活性，不凝集羊、牛、豬、禽類和人的O型紅細胞，但經(jīng)非離子去垢劑和脂溶劑處理后，可凝集小鼠的紅細胞[6-8]。

2 PRRSV的基因組結構

隨著對多個PRRSV毒株全基因組序列測定的完成，病毒基因組結構得到完全解析。病毒基因組大小約為15kb，為一條單鏈、不分節(jié)段的正鏈RNA，有9個開放閱讀框，分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7，每個閱讀框編碼特定的特異性蛋白。病毒基因組多數(shù)相鄰的閱讀框都有部分重疊，ORF1a編碼起始區(qū)的核心序列為5'-UAACCAUG-3'， 高 度 保 守 ，ORF1a和ORF1b重疊16個核苷酸，共同組成ORF1，各編碼一個多聚蛋白，占基因全長的80%，位于基因組5'端非編碼前導序列之后。ORF1b的翻譯是通過核糖體的滑動完成的。ORF1b含有四個獨特區(qū)：①聚合酶元序列；②富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指區(qū)；③三磷酸腺苷結合位點或蝸牛酶基元序列；④功能不明的保守區(qū)域。ORF1a和ORF1b的表達產(chǎn)物為非結構蛋白。其余閱讀框位于基因組3'端，是結構基因區(qū)。在ORF7終止密碼子之后是3'端非編碼區(qū)，含有poly(A)結構[9]，在該結構上游存在一個長約10 nt的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，高度保守。對比高致病性藍耳病的病毒基因組，發(fā)現(xiàn)與我國2005年以前分離的PRRSV相比，位于ORF1a的Nsp2基因中缺失了87個核苷酸，同源性僅為69.8%～86.2%。

3 PRRSV基因組的轉(zhuǎn)錄及表達

與其他正鏈RNA病毒一樣，PRRSV基因組具有基因組復制和mRNA轉(zhuǎn)錄的雙重功能。ORF1a與ORF1b直接由病毒基因組RNA表達。PRRSV基因組通過產(chǎn)生6個亞基因組mRNA表達，它們擁有共同的前導序列，位于病毒基因組5'端非編碼區(qū)，長度超過200個堿基。各亞基因組RNA的3'端相同，形成對應mRNA2～7有共同3'端的亞基因組mRNA，從而形成一個嵌套式結構。這種基因表達模式與冠狀病毒和凸隆病毒類似，且前導序列與mRNA序列間的連接區(qū)高度保守。有些PRRSV分離株產(chǎn)生7個亞基因組mRNA[10]，從ORF2～ORF7轉(zhuǎn)錄的mRNA分子之間多出一個亞基因組mRNA,試驗證明這種差別與對肺的毒力和缺陷性干擾顆粒RNA無關。

4 病毒感染

PRRSV具有顯著的單核細胞或巨噬細胞嗜性。病毒進入豬肺巨噬細胞有幾個步驟：PRRSV病毒粒子黏附到巨噬細胞表白的硫酸乙酰肝素上；病毒經(jīng)唾液酸殘基與病毒包膜上的M/GP5蛋白結合物，與唾液酸黏附素形成更緊密結合物；在與唾液酸黏附素黏附以后，病毒和細胞受體復合物內(nèi)吞形成籠形蛋白包裹的小泡。一旦內(nèi)吞作用實現(xiàn)，病毒基因組會在內(nèi)吞酸化作用下釋放。病毒基因組釋放還與CD163（清道夫蛋白）有關，同時病毒糖蛋白、GP2和GP4之間相互作用，這取決于功能CD163清道夫受體富含半胱氨酸結構域。另外，病毒入侵巨噬細胞的最后階段需要一些蛋白酶參與。一旦病毒基因組在宿主細胞中釋放，便開始轉(zhuǎn)錄和翻譯形成新的病毒粒子。以上是PRRSV體外入侵巨噬細胞的過程[11]。

5 PRRSV免疫學研究

PRRSV的免疫學研究目前還是一項極具挑戰(zhàn)性的課題。有關PRRSV感染的先天免疫的研究報道較少，有限的文獻表明，機體針對PRRSV的天然免疫應答很弱，幾乎沒有IFN-a的應答，炎性細胞因子的產(chǎn)生是極少量的和延遲的，NK細胞的激活和增殖也不顯著。PRRSV感染后可以產(chǎn)生強而快速的體液免疫反應，非中和抗體水平相對較高，在感染的早期就產(chǎn)生，而中和性抗體則要1～2月才產(chǎn)生。PRRSV的感染具有抗體依賴性增強作用，使得前期產(chǎn)生的抗體不能提供保護甚至是有害的。感染豬體液免疫產(chǎn)生的抗體主要是針對PRRSV的N蛋白、M蛋白和GP5蛋白。檢測豬血清和口腔分泌物的試驗中發(fā)現(xiàn)，血清中 IgM、IgA、IgG分別在預防免疫的第7天、第10天和第10天首次檢測到，口腔分泌物中的IgM、IgA、IgG分別在免疫的第3～10天、7～10天和8～14天檢測到[12]。PRRSV的特異性循環(huán)抗體可持續(xù)至少一年。另外，針對PRRSV非結構蛋白的抗體成分也可于感染后的1～4周檢出。研究表明，PRRSV感染豬后能引起機體抗原特異性和劑量依賴性的細胞免疫反應。豬在人工感染和自然感染PRRSV的條件下，CD4+和CD8+T細胞的比率急劇下降。豬全身免疫應答分析表明，翻譯方式和線粒體能量代謝的途徑是相互聯(lián)系的，以生物學功能為基礎伴隨翻譯調(diào)節(jié)，包括蛋白質(zhì)合成、RNA-post轉(zhuǎn)錄基因表達和細胞的生長、增殖等。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子如MYCN、MYC、NFE2L2與免疫應答有潛在的關系。病原刺激機體產(chǎn)生特異性免疫，還與TREM 1、toll樣受體、超細胞因子(hyper)和hyper趨化因子信號等有關。此外，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性和外源性免疫應答與抗炎反應調(diào)節(jié)有關。最值得注意的是，轉(zhuǎn)錄因子與HMGB1有潛在的聯(lián)系，HMGB1是病毒核苷酸內(nèi)部識別所必須的。其他轉(zhuǎn)錄因子像干擾素調(diào)節(jié)因子IRF1、IRF3、IRF5和IRF8也與PRRSV感染豬的特異性免疫有關[13]。

6 PRRSV的傳播方式和流行病學特點

PRRS一年四季均可發(fā)病，不同品種、年齡、性別的豬均可感染，主要侵害繁殖母豬和仔豬。病毒可通過多種途徑感染豬，且具有高度的感染性。群內(nèi)水平傳播是由于排毒、污染所至，病毒可通過病豬口腔、鼻腔、眼、腹腔和生殖道等傳播。帶毒母豬通過胎盤，帶毒公豬通過精液在豬群內(nèi)垂直傳播給胚胎以及新生仔豬。引入外來帶毒豬也能造成本病的傳播和流行。同時，有人認為鳥類可能攜帶病毒，使得本病長距離傳播。此外，空氣傳播是PRRS的一個重要傳播途徑，特別是短距離內(nèi)。

PRRSV在豬體內(nèi)可持續(xù)存在數(shù)月或更長時間，但并不一定表現(xiàn)明顯癥狀，這種持續(xù)隱性感染是PRRSV流行病學的一個重要特點。病毒血癥的持續(xù)存在，導致PRRS的循環(huán)傳播，這是PRRSV持續(xù)感染的重要原因之一。初產(chǎn)母豬極易感染PRRSV，也是病毒在豬群中持續(xù)存在的另一因素。

7 遺傳變異和疫苗研究

總結來自各國的PRRS流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PRRSV在抗原性、毒力性和遺傳性方面已經(jīng)發(fā)生了變異。根據(jù)不同病毒的遺傳學特性和抗原性質(zhì)，目前將該病毒主要分為兩個基因型：歐洲型（LV株為代表株）和美洲株（ATCC-VR2332株為代表株），兩者核苷酸同源性僅為60%。為了更清楚地了解PRRSV各個分離株之間的進化關系，Meng[14]等從多個國家收集了66個PRRSV分離株，對它們的全基因序列進行比較分析，繪制遺傳進化樹。分析表明，在每個主要基因型內(nèi)部，各個亞型之間的ORF5基因較為活躍，ORF7基因相對保守。整個結構基因的遺傳進化樹所顯示的變異程度是最大的，歐洲株和美洲株是兩個截然不同的基因型。分析來自中國大陸、中國臺灣、危地馬拉、日本和丹麥五個地區(qū)的分離株發(fā)現(xiàn)，其親緣關系均與美洲毒株接近。分析中發(fā)現(xiàn)，3個丹麥分離株、中國分離株（S1）、加拿大分離株（PA8）、Nebraska分離株（E16244B）的遺傳進化位置與弱毒疫苗病毒（MLV）—Resp PRRSV和VR2332的位置非常接近，可能由于丹麥許多豬場接種過VR2332弱毒疫苗,可見弱毒苗的使用對于PRRSV在豬群中持續(xù)感染具有重要意義。遺傳變異性產(chǎn)生的機制目前尚不清楚。

目前對于PRRS還是以預防為主，疫苗主要是弱毒苗和滅活苗。弱毒疫苗誘導的免疫反應持續(xù)時間較長，許多國家都研制了針對該病的商品化疫苗，對于控制該病的傳播和蔓延產(chǎn)生了積極作用。但是，免疫的同時也帶來了負面作用，尤其是使用弱毒疫苗接種豬群后，可能導致病毒血癥的發(fā)生，且對變異較大的病毒交叉免疫保護性低。有些商品疫苗只能保護豬群臨床上不發(fā)病，但不能抵抗病毒的感染。更為可怕的是，一些弱毒疫苗毒株發(fā)生返祖現(xiàn)象[15,16]，造成PRRS再度暴發(fā)。使用滅活苗較為安全，但需要多次免疫，且免疫持續(xù)期短。PRRSV具有逃避或調(diào)控免疫系統(tǒng)的能力，以及病毒本身免疫應答的復雜性，使用一種疫苗很難根除疾病。要研發(fā)出有效、通用、安全和能區(qū)別免疫的疫苗對于科研工作者來說是一項嚴峻的挑戰(zhàn)。近年來，人們逐漸開始研究活載體疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗等基因工程疫苗，已有將PRRSV GP5與豬偽狂犬病毒進行重組的研究。DNA疫苗以及可以作為核酸疫苗的候選基因也正在研制中。

8 結語

PRRSV可引起豬群多系統(tǒng)病癥，并易繼發(fā)細菌和多種病毒感染，使豬群死亡率增加，生長緩慢，增加飼養(yǎng)成本，生產(chǎn)性能下降。PRRS已遍及很多國家，2006年中國大規(guī)模暴發(fā)了高致病性PRRS，又名為藍耳病或高熱病。疾病蔓延至十多個省份，給養(yǎng)豬業(yè)帶來慘重的經(jīng)濟損失。此后，2007年和2008年在其他亞洲國家，如越南、菲律賓，相繼有暴發(fā)高致病性PRRS的報道。這些數(shù)據(jù)表明，PRRSV基因組存在高度變異性，因此對于疫苗的研究發(fā)展是一項挑戰(zhàn)。同時，PRRSV在不斷進化逃避豬抗病毒的免疫應答。一旦病毒感染機體組織，病毒本身的一些機制可以逃避豬的免疫系統(tǒng)，延緩保護性抗體的產(chǎn)生，在這種情況下，病毒便可以持續(xù)感染豬群，疫苗和藥物往往無法達到應有的效果，更增加了治療該病的難度。規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中當該疫病暴發(fā)時，配合使用高免血清與疫苗是緊急控制的有效措施之一，本研究室正在進行這項工作的研究。目前關于PRRSV分子生物學方面的研究進展迅速，研究側重對免疫原性基因及致病基因的篩選、改造和利用，相信隨著研究的深入，控制和預防PRRS為期不遠。

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