謝光洪(綜述),趙 逵(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物研究進(jìn)展

謝光洪(綜述),趙 逵(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

腫瘤干細(xì)胞；結(jié)腸癌；表面標(biāo)志物；共表達(dá)

結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一種消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段、多因素異常積累且相互作用的復(fù)雜過(guò)程。直到目前為止其具體發(fā)生機(jī)制尚不是很清楚，但是研究者們認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生主要有以下幾種理論：一是“腺瘤-癌”理論，80%以上的結(jié)腸癌都是來(lái)自于這條途徑；二是“基因突變”理論，個(gè)別基因發(fā)生突變后慢慢積累直到改變了原來(lái)的遺傳物質(zhì)從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；三是“炎癥-癌”理論，現(xiàn)在比較新的觀(guān)點(diǎn)是炎癥就是一種癌前病變，如果炎癥沒(méi)有得到有效的控制經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后就會(huì)發(fā)展為癌癥，結(jié)腸炎最終演變?yōu)榻Y(jié)腸癌就屬于這一類(lèi)；四是“腫瘤干細(xì)胞”理論，即研究者認(rèn)為在腫瘤中存在少量的腫瘤干細(xì)胞，它們是腫瘤細(xì)胞的“祖先”，能夠分化成腫瘤細(xì)胞。現(xiàn)主要論述腫瘤干細(xì)胞理論。

1 腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞[1](Cancer Stem Cell)是一類(lèi)能自我更新、無(wú)限增殖并具有多向分化潛能的含量極少的細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中所占的百分比不足1%。極少量這種細(xì)胞就能分化成新的腫瘤細(xì)胞進(jìn)而增殖形成腫瘤。20世紀(jì)70年代Nowell等[2]首先在白血病患者組織中提取出了極少量這種具有無(wú)限增殖潛能的細(xì)胞， 并將它以極低濃度移植到具有嚴(yán)重免疫缺陷的小鼠身上，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞能進(jìn)一步增殖并形成和原來(lái)表型相同的細(xì)胞，由此提出了白血病干細(xì)胞理論。近年來(lái)，它已經(jīng)擴(kuò)展到包括腦、乳腺腫瘤和結(jié)腸癌等實(shí)體瘤中。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)CSC不完全一樣，它具有明顯的異質(zhì)性，可分為增生、耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為不同的亞群細(xì)胞。目前對(duì)腫瘤干細(xì)胞特性和功能的研究成為腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

2 結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物

腫瘤干細(xì)胞研究的關(guān)鍵是如何從腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞中分離出腫瘤干細(xì)胞。目前主要有三種方法進(jìn)行分選：①采用無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞抱團(tuán)生長(zhǎng)形成細(xì)胞球；②Hoechest熒光染料法；③表面標(biāo)志物分選法，比較常用的分選手段有流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法。兩種方法都是利用腫瘤干細(xì)胞表面特異的分子和相應(yīng)的抗體結(jié)合，從而分離出結(jié)腸癌干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中比較特異的標(biāo)志物主要有CD133 、CD44、CD166，以及ALDH1和LGR5等。2003年Al-Hajj[3]等通過(guò)特異的細(xì)胞表面標(biāo)志ESA+CD44+CD24-分離出了乳腺癌干細(xì)胞。不久，研究者們又相繼分離出了結(jié)腸癌、肝癌、腦癌等腫瘤干細(xì)胞。由此證實(shí)了在腫瘤干細(xì)胞表面有相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。為確定分選出來(lái)的是否是腫瘤干細(xì)胞，必須得比較其不同干細(xì)胞亞群間的增殖克隆能力、分化潛力等。驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)來(lái)比較干細(xì)胞群的成瘤能力，如果用極低濃度的干細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)不久會(huì)產(chǎn)生腫瘤而且表型和原來(lái)一樣，那么這種細(xì)胞就是腫瘤干細(xì)胞。下面介紹幾個(gè)典型的結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物。

2.1 CD133 CD133[4]是腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一，1997 年 Miraglia[5]等發(fā)現(xiàn)一種新型造血干細(xì)胞標(biāo)志物AC133 蛋白，該蛋白在第七屆國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議(mDAW)上被正式命名為 CD133。它由C端和N端組成，C末端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，N端結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜上。研究表明CD133是很多腫瘤的表面標(biāo)志物，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Vitianil等對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中有CD133+細(xì)胞的表達(dá)。 2006 年O’Brien等[6]從人結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本中分離到1.7%～22.4% CD133 +細(xì)胞，并通過(guò)有限稀釋法，將不同濃度的 CD133 +細(xì)胞接種 NOD/ SCID 小鼠腎被囊，復(fù)制出原腫瘤細(xì)胞，且腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的表型變化，證實(shí)了 CD133 +的人結(jié)腸癌干細(xì)胞具有自我更新和分化、重建成結(jié)腸癌細(xì)胞群體的能力。因此，CD133可以作為結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

2.2 CD44 CD44是一個(gè)糖基化的細(xì)胞表面黏附分子，廣泛分布于T淋巴細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞[7]。CD44+的細(xì)胞能夠刺激新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[8-9]。大量的研究發(fā)現(xiàn) CD44在多種腫瘤細(xì)胞中均有高表達(dá)，在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中 CD44分子表達(dá)增強(qiáng)，與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，其表達(dá)水平是結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后的標(biāo)志[10-11]。最新研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29里面CD44+分子的百分比為80%以上。CD44+分子在干細(xì)胞中的陽(yáng)性率約為0.22%。因此可以用CD44來(lái)分選結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞，CD44+的細(xì)胞具有很強(qiáng)的成瘤能力，它還能與CD166(白細(xì)胞活化黏附分子)聯(lián)合運(yùn)用分選腫瘤干細(xì)胞。研究證明敲除CD44基因會(huì)使結(jié)腸癌干細(xì)胞喪失成瘤能力，說(shuō)明CD44分子在維持腫瘤干細(xì)胞干性及調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)方面起著重要作用 。

2.3 CD166 CD166是一種活化的白細(xì)胞粘附分子，屬于IgG超家族的一種跨膜分子，是淋巴細(xì)胞CD6的一種配基，和CD6可以相互作用介導(dǎo)細(xì)胞之間的粘附，并與介導(dǎo)T細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)相關(guān)[12]，這種分子主要在結(jié)腸癌干細(xì)胞表面表達(dá)。CD166分子表達(dá)降低可以使腫瘤細(xì)胞的粘附能力下降，最近研究認(rèn)為CD166分子在腫瘤干細(xì)胞的相互作用中起了重要作用，并調(diào)控干細(xì)胞的分化。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD166在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、白血病干細(xì)胞中亦有表達(dá)。目前CD166分子被認(rèn)為是一種潛在的新型的結(jié)腸癌標(biāo)志物之一，并作為抗癌藥物的作用靶點(diǎn)。這種分子在結(jié)腸正常組織中無(wú)表達(dá)，在腺瘤及癌組織中部分表達(dá),但癌組織中表達(dá)較腺瘤明顯增高，其表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的分化程度相關(guān)。WEICHERT 等[13]通過(guò)western-blot發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌CD166蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于正常大腸組織，利用RT-PCR檢測(cè)大腸癌CD166 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率顯著高于正常大腸組織, 由此推測(cè)CD166在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色。

2.4 乙醛脫氫酶1(ALDH1) ALDH1是一個(gè)與腫瘤干細(xì)胞代謝有關(guān)的一種酶[14]，它的作用主要是將干細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸。研究發(fā)現(xiàn)活化的ALDH1對(duì)烷化劑具有很強(qiáng)的耐受性及抗氧化能力，因此它能夠?qū)е履[瘤耐藥性的發(fā)生。最近研究中Ginestier[15]等證實(shí)ALDH1是一種新的乳腺癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子，也是乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)腸癌中ALDH1+高表達(dá)的細(xì)胞能夠作為結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞[16]的一個(gè)標(biāo)志物。ALDH1一般處于結(jié)腸的隱窩組織中[17-18]。結(jié)腸炎病人在隱窩組織中的的ALDH1的含量會(huì)增高，癌組織中更高。ALDH1已經(jīng)在白血病，乳腺癌和腦癌等腫瘤中被證實(shí)存在，現(xiàn)在在結(jié)腸炎性結(jié)腸癌中也被證實(shí)存在。利用離體實(shí)驗(yàn)證明，ALDH1不斷升高的人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。ALDH+的細(xì)胞中包含一個(gè)亞群細(xì)胞，這個(gè)亞群細(xì)胞能夠作為細(xì)胞和分化潛能和最大的生長(zhǎng)能力標(biāo)志。結(jié)腸癌中，高表達(dá)的ALDH1證明能夠致瘤，就像其他腫瘤一樣并且具有自我更新的能力。在大量實(shí)驗(yàn)中證明，通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)，ALDH1的表達(dá)和腫瘤的預(yù)后有關(guān)。將ALDH1陽(yáng)性的原發(fā)性腫瘤移入具有免疫缺陷的小鼠，以此來(lái)決定腫瘤起始和分化潛力。觀(guān)察2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)85%以上的小鼠患上了腫瘤。以上這些發(fā)現(xiàn)為結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞理論的研究提供了一個(gè)重要而嶄新的方向。

2.5 LGR5 LGR5屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，最初是從結(jié)腸癌細(xì)胞中分離出來(lái)的[19-20]。Lgr5是含有18個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個(gè)跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白，是最新發(fā)現(xiàn)的Wnt途徑的靶基因，還是潛在的干細(xì)胞標(biāo)記物，并且與腫瘤的形成和發(fā)展都有很大的相關(guān)性，是結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞具有相對(duì)特異性的一種蛋白質(zhì)，它位于結(jié)腸的基底隱窩細(xì)胞內(nèi)，大部分在胞漿(細(xì)胞質(zhì)中)表達(dá)，膜上有少部分表達(dá)。LGR5蛋白在結(jié)腸癌干細(xì)胞中的陽(yáng)性率達(dá)56.3%。LGR5陽(yáng)性的細(xì)胞可能包含有更多的腫瘤干細(xì)胞，并且LGR5表達(dá)的增加和腫瘤浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。并在結(jié)腸癌的惡化和預(yù)后方面扮演了重要角色，可以作為治療效果的一個(gè)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)LGR5是干細(xì)胞Wnt/B-catenin信號(hào)通路中最好的一個(gè)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物。荷蘭學(xué)者Barker等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LGR5 在小腸和結(jié)腸隱窩特異性表達(dá)，并證實(shí)LGR5為小腸和結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。McClanahan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，利用 RNA干擾技術(shù)敲除培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)的LGR5基因，腫瘤細(xì)胞凋亡下降。Yui等[23]將一個(gè)LGR5+結(jié)腸腫瘤細(xì)胞植入到小鼠體內(nèi)，不久小鼠長(zhǎng)出一個(gè)腫瘤，細(xì)胞表型和原來(lái)的表型一樣。研究還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞系中Lgr5的表達(dá)較高。此外，Lgr5家族可介導(dǎo)R-脊柱蛋白參與Wnt 經(jīng)典信號(hào)通路[24-25]，并證實(shí)Lgr受體與R-脊柱蛋白密切結(jié)合，即使是少量Wnt信號(hào)刺激時(shí)也能夠增強(qiáng)Wnt的信號(hào)作用，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生。Carmon等[26]關(guān)于Lgr5與Wnt受體的相互作用的研究表明Lgr5是Wnt信號(hào)復(fù)合體的一部分，并在膜水平增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)。關(guān)于Lgr5是如何增強(qiáng)Wnt信號(hào)的機(jī)制依然不清楚。因此，Lgr5是目前對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞最具有特異性的一個(gè)標(biāo)志物。

3 結(jié)腸癌CSC標(biāo)志物共表達(dá)

為了研究結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性， 如何從組織或細(xì)胞中分離出腫瘤干細(xì)胞是關(guān)鍵的一步。目前最常見(jiàn)的方法是利用一個(gè)或幾個(gè)干細(xì)胞表面分子抗體分選腫瘤干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物存在共表達(dá)的現(xiàn)象。即同時(shí)有不同的腫瘤標(biāo)志物分子在同一腫瘤干細(xì)胞表面表達(dá)。這種現(xiàn)象為提高腫瘤干細(xì)胞的分選率打開(kāi)了另外一個(gè)視野?，F(xiàn)在研究中用的比較多的是CD24聯(lián)合CD29分子，或者用CD44聯(lián)合CD166分子共同分選結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞。

4 展望

腫瘤干細(xì)胞理論已經(jīng)在相關(guān)腫瘤中得到了證實(shí)，但是對(duì)它的研究尚處于初步階段。結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞理論更是使人們對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面有了全新的認(rèn)識(shí)。但是結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞之間的關(guān)系究竟如何，以及怎么尋找結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，以此來(lái)分離和純化腫瘤干細(xì)胞等將成為研究的熱點(diǎn)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)的不斷進(jìn)展，將來(lái)可能發(fā)現(xiàn)更多具有特異性的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，對(duì)這些腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性和分子免疫學(xué)等研究，并以這些異性標(biāo)志物為藥物治療靶點(diǎn)，那么我們有理由相信將來(lái)人類(lèi)克服腫瘤的這條道路會(huì)變得更加平坦。

[1] Kopper L,Hajdu M. Tumor stem cells[J].Patholoncol Res,2004,10(2):69-73.

[2] Nowell P C.The clonal nature of neoplasia[J]. Cancer Cells,1989,1(1):29-30.

[3] Al-Hajj M, Wicha M S, Benito-Hernandez A,et al.Prospective identifcation of tumorigenic breast cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:3983-3988.

[4] Breathnach R , Chambon P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins[J] . Annu Rev Biochem, 1981,50:349-383.

[5] Miraglia S , Godf rey W, Yin A H , et al.Anovel five transmembrane hematopoietic stem cell antigen : isolation, characterization and molecular cloning[J]. Blood,1997,90(12):5013-5021.

[6] O ’Brien C A , Pollett A , Gallinger S , et al . A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J] . Nature ,2007,445 (7123):106-110.

[7] Yakanamii,Nakano K,Yasumotok, et al.CD44: functional relevance to inflammation and malignancy [J]. Histol Histopathol, 2002, 17 (3):945-950.

[8] Sum Iyoshita Y,Maekawa T.Expression of CD44, vascular endothelial growth fact or, and proliferating cell nuclear antigen in severe venous invasional colorectal cancer and its relationship to livermetastasis[J]. Surg Today,2000,30(4):323-327.

[9] Sokmen S,Lebe B,Saroglu S, et al . Prognostic value of CD44 expression in colorectal carcinomas [J]. Anticancer Res, 2001, 21 (6) : 4121-4126.

[10] Bendardaf R, A lgars A, Elzagheid A, et al . Comparison of CD44 expression in primary tumours and metastases of colorectal cancer[J].Oncol Rep, 2006, 16 (4): 741-746.

[11] Bendardaf R, Elzagheid A, Lamlum H,et al.Ecadherin, CD44s and CD44v6 correlate with tumour differentiati on in colorectal cancer[J]. Oncol Rep,2009,13 (5):831-835.

[12] Zimmerman A W.Longterm engagement of CD6 andALCAM is essent ial for T - cell proliferation induced by dendrit ic cells[J].Blood,2006,107(8):3212-3220.

[13] Weichert W,Selt K, Bellachj,et al.ALCAM /CD166 is overexp ressed in colorectal carcinoma and correlates with shortened patien t su rvival [J].J Cl in Pathol,2004,57(11):1160-1164.

[14] Armstrong L, Stojkovic M, Dimmick I, et al. Phenotypic characterization of murine primitive hematopoietic progenitor cells isolated on basis of aldehyde dehydrogenase activity[J]. Stem Cells,2004,22:1142-1151.

[15] Ginestier C, Hur M H, Charafe-Jauffret E, et al. ALDH1 Is a Marker of Normal and Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome[J]. Cell Stem Cell,2007,1:555-567.

[16] Dylla S J, Beviglia L, Park I K, et al.Colorectal cancer stem cells are enriched in xenogeneic tumors following chemotherapy[J].PLoS ONE,2008,3(8):2428-2430.

[17] Potten C S, Loeffler M.Stem cells:attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties[J]. Lessons for and from the crypt Development,1990,110:1001-1020.

[18] Preston S L, Wong W M, Chan A O,et al.Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas: origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission[J]. Cancer Res,2003,63:3819-3825.

[19] Vande Wetering M,Sancho E,Verweij C,et al.The β-cate-nin /TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells [J].Cell,2002,111(2): 241-250.

[20] Hsu S Y,Liang S G,Hsueh A J,et al.Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G-protein-coupled,seven-transmembrane region[J].MolEndocrinol,1998,12 (12):1830-1845.

[21] Barker N,van Es J H,Kuipers J,et al.Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5 [J]. Nature,2007,449(7165) :1003-1007.

[22] McClanahan T,Sandra K,Kathleen S,et al. Identification of over-expression of orphan Gprotein-coupled receptor GPR49 in human colon and ovarian primary tumors[J].Cancer Biol Ther,2006,5(4) :419-426.

[23] Yui S, Nakamura T.Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+stem cell[J].Nature medicine,2012,18:618-623.

[24] Carmon K S, Gong X, Lin Q, et al. R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2011, 108(28):11452-11457.

[25] Glinka A, Dolde C, Kirsch N, et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediate ng Wnt/β-catenin and Wnt/PCP signaling[J].Embo Rep,2011,12(10):1055-1061.

[26] Carmon K S, Lin Q, Gong X,et al.LGR5 interacts and cointernalizes with Wnt receptors to modulate Wnt/β-catenin signaling[J].Mol Cell Biol，2012，32(11):2054-2064.

貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(NO：TZJF-2011-32)。

趙逵，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：大腸癌,E-mail:kuizhao95868@MSN.com。

R735.3

A

1000-2715(2013)05-0491-04

[收稿2013-06-03;修回2013-07-10]

(編輯：王福軍)