徐國(guó)棟

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津宜興埠北 300402）

近10年來,全球的哺乳仔豬不時(shí)承受著不明致病因子所致腹瀉的危害，此類腹瀉癥候群被稱為新生仔豬腹瀉，獸醫(yī)工作者仍在為尋找最可能的病原進(jìn)行著努力，近來，Per Wallgren等[1-2]（瑞典）認(rèn)為大腸桿菌并非此類疾病的致病因子，真正的病原可能是某種病毒，并宣布已經(jīng)找到了一個(gè)可能的致病因子。H Kongsted等[3]（丹麥）同樣認(rèn)為產(chǎn)腸毒大腸桿菌（ETEC）、C-型產(chǎn)氣梭菌、輪狀病毒（PRoV）都不是該癥候群的主要致病原。HT Hoang等[4]（韓國(guó)）則認(rèn)為美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的新生仔豬PRoV 相關(guān)腸炎尤為重要，2011年愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室使用RT-PCR 方法對(duì)2461例豬腹瀉病例糞便或腸道內(nèi)容物進(jìn)行PRoV A、B、C（依輪狀病毒VP6抗原性不同可劃分7個(gè)已知血清型，A、B、C、E4個(gè)血清型與豬腹瀉有關(guān)）血清型調(diào)查，結(jié)果33.9%樣品呈陽性，通過溯源分析發(fā)現(xiàn)C 型PRoV 常見于新生豬腹瀉、A 型PRoV 是斷奶后仔豬腹瀉的主要原因。同年，T Opriessnig等[5]（美國(guó)）發(fā)表了依阿華州立大學(xué)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室基于對(duì)88份有腹瀉史病豬的糞便樣品（源于哺乳仔豬13份、源于39個(gè)、源于不確定日齡19個(gè)）檢測(cè)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)檢出率較高的病原依次是星狀病毒4 型（陽性率53.4%）、豬細(xì)環(huán)病毒2 型（陽性率48.9%）、豬細(xì)環(huán)病毒1 型（陽性率31.8%），并推測(cè)前兩種病原很可能在生長(zhǎng)育肥豬群廣泛流行。

在亞洲地區(qū)，最讓養(yǎng)豬業(yè)者關(guān)注的是豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea Virus，PEDV）所致哺乳仔豬的流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）[6-10]。

在國(guó)內(nèi)，盡管發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致新生仔豬腹瀉的病因很多，但2010年至2012年，多數(shù)學(xué)者從表現(xiàn)有嘔吐、水樣腹瀉、迅速脫水、高死亡率為特征的新生仔豬樣品中分離到PEDV?？梢哉J(rèn)為：PEDV 是近三年來引起新生仔豬腹瀉最重要病原[11-22]。在此，筆者就近三年來國(guó)內(nèi)PED 的流行情況綜述如下：

1 國(guó)內(nèi)豬群感染現(xiàn)狀

陳強(qiáng)等[11]在2009年3～6月間對(duì)福建省16個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的6～60日齡腹瀉仔豬糞便進(jìn)行致病性大腸桿菌（EPEC）、流行性腹瀉病毒（TGEV）、PEDV、PRoV 的檢測(cè)（PCR 或RTPCR ），結(jié)果1個(gè)豬場(chǎng)EPEC陽性（場(chǎng)陽性率6.25%）；1個(gè)豬場(chǎng)TGEV陽性（場(chǎng)陽性率6.25%；TGEV：豬傳染性胃腸炎病毒）；3個(gè)豬場(chǎng)PEDV陽性（場(chǎng)陽性率18.75%）；3個(gè)豬場(chǎng)PRoV陽性（場(chǎng)陽性率18.75%）；1個(gè)豬場(chǎng)EPEC和PEDV 兩種病原因子同時(shí)呈陽性。張志等[12]在2010年～2011年上半年間所采集的腹瀉豬糞便樣品中檢測(cè)到PEDV 變異株，且與2011年韓國(guó)流行株的同源性最高，針對(duì)部分豬場(chǎng)流行病學(xué)追溯發(fā)現(xiàn)，盡管多數(shù)豬場(chǎng)均免疫過TGE－PED二聯(lián)苗，但部分仔豬發(fā)病率仍高達(dá)90%，死亡率50%以上。Wentao Li等[13]在2011年1～10月間，從國(guó)內(nèi)12個(gè)省、57個(gè)豬場(chǎng)共采集到455份樣品，檢測(cè)（RT-PCR）到PEDV陽性場(chǎng)45個(gè)（場(chǎng)陽性率78.95%），檢出PEDV陽性樣品278份（樣品陽性率為61.10%）。陳建飛等[14]對(duì)2011年3月份后采集的11個(gè)省（市）28個(gè)豬場(chǎng)共計(jì)139份哺乳仔豬腹瀉樣品（糞便或小腸內(nèi)容物）進(jìn)行了檢測(cè)（免疫膠體金、RTPCR），檢出含PEDV 樣品76份（樣品陽性率54.7%），檢出含TGEV 的樣品53份（樣品陽性率38.1%），檢出同時(shí)含PEDV和TGEV 的樣品36份（樣品陽性率25.9%），檢出含豬PoRV 的樣品7份（樣品陽性率為5.04% ），檢出含豬嵴病毒（kobuvirus）的樣品2份（樣品陽性率為1.44%），由此認(rèn)為近來國(guó)內(nèi)新生仔豬腹瀉病的主要病原為PEDV，其次為TGEV。G wang等[15]在2011年間收集到國(guó)內(nèi)主要養(yǎng)豬省份48個(gè)豬場(chǎng)、756份腹瀉仔豬的小腸樣品，檢測(cè)（RTPCR）結(jié)果PEDV陽性場(chǎng)26個(gè)（場(chǎng)陽性 率54%）；PEDV陽性樣品278份（樣品陽性率54.6%）。劉孝珍等[16]對(duì)2011年間自國(guó)內(nèi)10個(gè)省2個(gè)直轄市（福建、廣東、廣西、河南、河北、山東、吉林、黑龍江、新疆、浙江、北京、上海）、共計(jì)55個(gè)嚴(yán)重腹瀉場(chǎng)采集到的219份仔豬小腸和糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)（免疫膠體金、RT-PCR），結(jié)果單獨(dú)感染PEDV 的場(chǎng)9個(gè)（場(chǎng)陽性率16.36%）；同時(shí)檢出TGEV和PoRV 的場(chǎng)29個(gè)（場(chǎng)陽性率52.73%）；單獨(dú)檢出PEDV 的病料73份（樣品陽性率33.33%），同時(shí)檢出TGEV和PoRV 的 病料61份（樣品陽性率27.85%），匯總顯示腹瀉場(chǎng)豬群存在PEDV 感染占69.09%，病料中可檢測(cè)到PEDV 的占61.19%。張志等[17]對(duì)2011年間采自河南省和遼寧省2個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的2～7日齡水樣腹瀉仔豬的糞便樣品進(jìn)行了PEDV、TEGV和PRoV 檢測(cè)(巢式RT-PCR)，檢出PEDV陽性樣品43份（樣品陽性率100%），未檢測(cè)到TEGV和PRoV陽性樣品。所檢測(cè)到的多株P(guān)EDV，經(jīng)過基因測(cè)序分析和動(dòng)物試驗(yàn)，顯示2011年流行的PEDV 毒株為新流行株。甘海霞等[18]對(duì)2011年間自廣西34個(gè)縣、144個(gè)豬場(chǎng)采集的216份腹瀉糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)（RT-PCR），檢出PEDV陽性樣品60份（樣品陽性率27.78%），檢出TGEV陽性樣品16份（樣品陽性率7.41%），認(rèn)為廣西境內(nèi)豬群腹瀉病原主要為PEDV，哺乳仔豬發(fā)病率和病死率較高。徐國(guó)棟等[19]在2011年未對(duì)流行于天津地區(qū)的哺乳仔豬腹瀉進(jìn)行了以TEGV、PEDV、PRoV、PRV（偽狂犬病病毒）、CSFV（豬瘟病毒）、PRRSV（藍(lán)耳病毒病毒）、霉菌毒素中毒為主要致病因子的調(diào)查，最終認(rèn)為PEDV是致哺乳仔豬腹瀉的主要病原。Fei-Fei Ge等[20]對(duì)2011年9月～2012年1月間自上海26個(gè)豬場(chǎng)采集的豬腸道和糞便樣本135個(gè)（其中18個(gè)豬場(chǎng)的95 頭豬在有腹瀉疾病時(shí)取樣，其他樣品采自無臨床癥狀的豬）進(jìn)行了病原的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品PEDV陽性率為26.3%，TGEV陽性率為3.1%，PRoV陽性率為8.4%，PRV陽性率為35.8%，胞內(nèi)勞森氏菌陽性率4.2%，但是健康豬群的PEDV、PRV陽性率分別為0%、92.5%。由此認(rèn)為PEDV和PRV 兩種病原在豬腹瀉中發(fā)揮重要作用，而由PEDV陽性率與腹瀉的相似性推斷PEDV 是2010年底引起上海地區(qū)豬腹瀉的主要因素。肖博仁[21]對(duì)2011年8月～2012年3月間自湖南省9個(gè)地區(qū)、13個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的60 頭腹瀉仔豬腸道及其內(nèi)容物樣品進(jìn)行了檢測(cè)（RT－PCR），結(jié)果PEDV陽性場(chǎng)9個(gè)（場(chǎng)陽性率69.2%），PEDV陽性仔豬39 頭（樣品陽性率為65%）。秦谷雨等[22]對(duì)2011年10月～2012年5月間自安徽37個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)收集到的腹瀉仔豬糞便或病死豬腸段共計(jì)186份進(jìn)行了PEDV、TGEV、PRoV、PRV、PCV－Ⅱ（豬圓環(huán)病毒Ⅱ型）五種病原的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PEDV陽性場(chǎng)28個(gè)（場(chǎng)陽性率75.7%）、病料陽性數(shù)110份（樣品陽性率59.1%）；TGEV陽性場(chǎng)占3個(gè)（場(chǎng)陽性率8.1%）、病料陽性數(shù)10個(gè)（樣品陽性率占5.4%）；PRoV陽性場(chǎng)1個(gè)（場(chǎng)陽性率2.7%）、病料陽性數(shù)5份（樣品陽性率2.7%）；PRV陽性場(chǎng)8個(gè)（場(chǎng)陽性率21.6%）、病料陽性數(shù)15份（樣品陽性率8.1%）；PCV－Ⅱ陽性場(chǎng)20個(gè)（場(chǎng)陽性率54.1%）、病料陽性數(shù)48份（樣品陽性率25.8%）；同時(shí)，PEDV和TGEV 混合感染占4.3%，PEDV和 PCV－Ⅱ混合感染占18.8%，PEDV和與PRV 混合感染占10.8%，PRV和PCV－Ⅱ混合感染占4.8%；其他病因50例，占26.9%。由此推斷PEDV、PCV－Ⅱ、PRV的單純或混合性感染是近來安徽境內(nèi)致仔豬腹瀉最重要的三種病原。2012年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)從國(guó)內(nèi)南部6 ?。◤V東、廣西、江西、四川、福建、江蘇）、48個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)所共收集的127份腹瀉糞便中均檢測(cè)到PEDV陽性樣品55份（樣品陽性率43.0%）[23]。

綜上所述，從以上研究者采集病料所分布的區(qū)域看，近三年來可檢測(cè)到PEDV 的仔豬群幾乎分布于全國(guó)范圍：福建、湖南、廣東、廣西、江蘇、安徽、浙江、江西、四川、山東、河南、河北、黑龍江、遼寧、吉林、北京、上海、天津、新疆，并且其它省份也有相關(guān)報(bào)道，如甘肅[24]、重慶[25]等，由此推斷，當(dāng)前國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖形勢(shì)下，幾乎不能找到無PEDV 感染豬群存在的省（市）。若對(duì)以上可查閱到的2010年后PEDV 文獻(xiàn)資料中所載有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行陽性場(chǎng)、抽樣陽性份數(shù)的粗略匯總，匯總時(shí)因陳建飛的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)與劉孝珍的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可能重復(fù)，則選擇劉孝珍的數(shù)據(jù)，甘海霞和Fei-Fei Ge 資料中的“陽性場(chǎng)數(shù)/總場(chǎng)數(shù)”不可計(jì)算，則可對(duì)得到的7組場(chǎng)、9組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是：場(chǎng)陽性率68.29%、樣品陽性率47.02%，因研究者的采樣多數(shù)源于腹瀉癥狀的豬場(chǎng)，所統(tǒng)計(jì)陽性率可能偏高于全國(guó)實(shí)情，但與以往報(bào)道相比，近三年來哺乳仔豬中PEDV 的檢出率仍略高于2010年前[11、19]，事實(shí)上，國(guó)內(nèi)多數(shù)養(yǎng)豬業(yè)者在近三年來感覺到：不知何種誘因?qū)е虏溉樽胸i發(fā)生PED 時(shí)的癥狀明顯加劇了。2012年11月13日，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了 《生豬腹瀉疫病防控技術(shù)指導(dǎo)意見（試行）》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2012〕23號(hào)）[26]，要求各級(jí)畜牧獸醫(yī)部門加強(qiáng)對(duì)生豬腹瀉疫病進(jìn)行針對(duì)性防治和綜合防疫管理，其中包括使用國(guó)家批準(zhǔn)使用的PED～TGE 二聯(lián)滅活疫苗免疫妊娠母豬。

2 國(guó)內(nèi)分子流行病學(xué)調(diào)查情況

做為單股正鏈RNA 冠狀病毒的PEDV，在復(fù)制過程中，因缺乏校對(duì)功能（而DNA 病毒復(fù)制過程中DNA 聚合酶具有這一功能）致錯(cuò)配率為10－3～10－4/nt，基因組越長(zhǎng)則丟失遺傳信息的機(jī)率越高。因這類病毒mRNA 為不連續(xù)轉(zhuǎn)錄，未完成mRNA 合成的mRNA 中間體可隨時(shí)從模板上脫落，脫落中間體具有與其它毒株的RNA模板重新結(jié)合的可能性，最終造成復(fù)制過程中的堿基突變[27-28]。Wentao Li等[13]對(duì)2011年1月到10月間所收集樣品中PEDV 的S 基因（纖突糖蛋白基因）分析發(fā)現(xiàn)：國(guó)內(nèi)PEDV 經(jīng)典毒株和變異毒株在同時(shí)流行，部分毒株與韓國(guó)弱毒株DR14 同源性較高，高死亡率豬場(chǎng)有變異PEDV 毒株的流行，這些變異株P(guān)EDV 基因組存在氨基酸的插入和點(diǎn)突變，傳統(tǒng)弱毒疫苗不能對(duì)豬群感染PEDV 變異毒株提供免疫保護(hù)，在攻毒實(shí)驗(yàn)中，變異毒株導(dǎo)致仔豬100%死亡。張志等[17]對(duì)2011年下半年收集的43份腹瀉樣品PEDV 的M 基因（膜糖蛋白基因）進(jìn)行測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)分離株均屬于基因G2.3 亞型，同源性為99.2%～100%，與2008年泰國(guó)和2011年2韓國(guó)和流株屬同于一個(gè)進(jìn)化分支，實(shí)驗(yàn)證明具強(qiáng)致病性。G wang等[15]對(duì)2011年間國(guó)內(nèi)不同地區(qū)收集的6個(gè)PEDV 野毒進(jìn)行M 基因和ORF3 基因（ORF3 蛋白基因，為PEDV 唯一輔助基因、與毒力有關(guān)）分子演化距離推測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些分離株已形成不同的新分支，國(guó)內(nèi)流行的PEDV 具有很強(qiáng)的突變和重組潛力，認(rèn)為病毒主要囊膜蛋白基因發(fā)生了相當(dāng)大的變異，但分離株保有了很強(qiáng)的致病性。劉孝珍等[16]對(duì)2011年間所分離27 株P(guān)EDV 的S 基因、N 基因、ORF3 基因進(jìn)行了分析：分離株S 基因核苷酸序列同源性為93.6%～99.9%，與其它參考株同源性為92.8%～100%，存在點(diǎn)突變、插入、缺失、重組現(xiàn)象，但包括參考株在內(nèi)所有S 蛋白抗原表位沒有明顯差異。所構(gòu)建的S 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示所分離的17個(gè)毒株屬于Ⅰ群的第1-1 亞群（該亞群還包括了部分韓國(guó)毒株如Knu0903等）、3個(gè)毒株屬于Ⅱ群的2-1 亞群（該亞群還包括了部分韓國(guó)毒株如Knu0801和日本株NK等）、7個(gè)毒株屬于Ⅱ群的2-2 亞群（該亞群還包括了部分韓國(guó)毒株和日本的毒株及經(jīng)典CV777 毒株等）。對(duì)20 株P(guān)EDV 分離株N基因核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)其同源性為95.2%～100%，與參考毒株相比存在點(diǎn)突變，未發(fā)現(xiàn)缺失和插入，但部分毒株存在重組現(xiàn)象。N 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示20 株分離株包含于Ⅰ群（其中包括CV777和部分韓國(guó)毒株等）中的有11 株、包含于Ⅱ群的只有3 株分離株、包含于Ⅲ群（其中包括了我國(guó)以前分離得到的部分毒株如JS-2004-2等）中的有6 株，可以看出N 基因變異仍較保守。對(duì)25 株P(guān)EDV 分離株ORF3 蛋白基因核苷酸序列分析顯示分離株同源性為95.2%～100%，與參考毒株相比，存在點(diǎn)突變，未發(fā)現(xiàn)缺失和插入。所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示包含于Ⅰ群（該群還包括了中國(guó)其它流行株、CV777株等）中的有23 株、沒有分離株包含于Ⅱ群中、包含于Ⅲ群（該群還包括了CH/BJ/2001、CH/HLJHH-1/2011、CV777等）中 的 有2 株，多數(shù)毒株(23/25) 與Brl/87 株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與韓國(guó)（如DR13、Chinju99等）親緣關(guān)系較近，即國(guó)內(nèi)有不同于疫苗株的新基因型PEDV在流行。Fei-Fei Ge等[20]對(duì)2011年9月～2012年1月間自上海地區(qū)所分離10 株P(guān)EDV 的681bp M 基因和675bpORF3 基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)所有分離株M 基因與Group3 親緣關(guān)系較近，不同于包括疫苗株在內(nèi)的其它毒株。分離株ORF3 基因與韓國(guó)株親緣關(guān)系較近。SH4 株由歐洲野毒株（CV777和Brl/87）進(jìn)化而來，SH5株由CV777 疫苗株演變進(jìn)化而來。由此推斷上海PEDV 流行株分離株存在遺傳多樣性。肖博仁[21]對(duì)2011年8月～2012年3月湖南地區(qū)流行的PEDV 部分S 基因擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在S 基因型的多樣性，與國(guó)內(nèi)其它省份流行毒株類似，只是個(gè)別分離株發(fā)生了點(diǎn)突變。構(gòu)建的S 基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該地區(qū)流行株可分兩個(gè)群：1個(gè)群與廣州、河南、黑龍江流行毒株相似，而可能是弱毒的株洲株與另一個(gè)群中的甘肅毒株和江蘇毒株相似。

綜上所述，雖然目前認(rèn)為PEDV只有一個(gè)血清型，但基于S 基因、ORF3 基因、M 基因點(diǎn)突變?yōu)橹鞯男禄蛐投局攴种纬煽赡苁菍?dǎo)致免疫效果較差的原因，有些毒株存在重組潛力，而部分學(xué)者分離到的弱毒株是否來源于疫苗毒仍是個(gè)疑問，在此提醒養(yǎng)殖者應(yīng)根據(jù)本場(chǎng)實(shí)情慎用弱毒疫苗。筆者認(rèn)為，除致病微生物的變異因素外，當(dāng)前國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)者更應(yīng)考慮以下兩點(diǎn)：（1）是否真正執(zhí)行了生物安全措施對(duì)PEDV 的傳播進(jìn)行防范。例如，確實(shí)對(duì)進(jìn)出場(chǎng)人員實(shí)行了嚴(yán)格的管理、確保對(duì)保育箱內(nèi)的腹瀉糞便及時(shí)清除和消毒、保證清污用具不會(huì)作為機(jī)械性傳播工具、對(duì)場(chǎng)內(nèi)糞污污染交叉點(diǎn)進(jìn)行了有效消毒、完全預(yù)料到了“返飼”攻毒可能的長(zhǎng)久性后遺效應(yīng)等。（2）是否考慮過豬群免疫系統(tǒng)功能紊亂或低下可能是PED 在某些豬場(chǎng)長(zhǎng)期循環(huán)式流行的重要原因。筆者在臨床中觀察到有時(shí)使用含本場(chǎng)PEDV 的病料返飼母豬群，被攻毒豬群或表現(xiàn)明顯的嘔吐、腹瀉癥狀，或根本就無任何癥狀出現(xiàn)，但仍不能在短期（如1～2個(gè)月內(nèi)）內(nèi)為所生產(chǎn)的哺乳仔豬提供強(qiáng)有力的被動(dòng)保護(hù)。在感染母豬群，有的個(gè)體反復(fù)出現(xiàn)軟便、稀便的癥狀，其后代仔豬腹瀉的機(jī)率很高。

[1]Per Wallgren，等.新生仔豬腹瀉－Ⅰ.發(fā)病豬臨床診斷結(jié)果[C].22 屆國(guó)際豬獸醫(yī)協(xié)會(huì)大會(huì)論文集選譯，中國(guó)農(nóng)機(jī)學(xué)會(huì)機(jī)械化養(yǎng)豬協(xié)會(huì)編譯，2012，成都：266.

[2]Per Wallgren，等.新生仔豬腹瀉－Ⅱ.病原學(xué)[C].22 屆國(guó)際豬獸醫(yī)協(xié)會(huì)大會(huì)論文集選譯，中國(guó)農(nóng)機(jī)學(xué)會(huì)機(jī)械化養(yǎng)豬協(xié)會(huì)編譯，2012，成都：267.

[3]H Kongsted，等.丹麥新生倉猝腹瀉――臨床特征[C].22 屆國(guó)際豬獸醫(yī)協(xié)會(huì)大會(huì)論文集選譯，中國(guó)農(nóng)機(jī)學(xué)會(huì)機(jī)械化養(yǎng)豬協(xié)會(huì)編譯，2012，成都：264.

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