武春芳，韓四娥

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特010030)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄獸動(dòng)物的嚴(yán)重急性傳染病，由于其傳播快，給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重影響國際貿(mào)易。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須上報(bào)的疫病之一，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疫病。FMDV包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和 SAT3 共 7 個(gè)血清型，血清型間無交叉保護(hù)，造成疫病控制難度較大。口蹄疫的防控是一個(gè)系統(tǒng)工程，高效、安全的疫苗是防止口蹄疫疫情發(fā)生的最有效方法之一。我國多年來一直采取轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式生產(chǎn)口蹄疫，該生產(chǎn)方式存在污染率高、收獲率低等問題，對疫苗質(zhì)量的控制存在一定的困難。從2009年開始，國內(nèi)部分口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)采用生物反應(yīng)器技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、病毒增殖等以來，口蹄疫疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(如效力評價(jià)指標(biāo))有了較大的提高，基本與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦標(biāo)準(zhǔn)接軌。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高疫苗質(zhì)量，保證免疫效果，農(nóng)業(yè)部規(guī)定自2013年9月1日起，國家強(qiáng)制免疫用口蹄疫疫苗將逐步執(zhí)行新的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 質(zhì)量控制的意義

1.1 國家強(qiáng)制要求 隨著國家對口蹄疫防控的重視和疫苗生產(chǎn)時(shí)間的延長，口蹄疫疫苗的監(jiān)管制度日趨完善，管理體系已基本形成。研制環(huán)節(jié)有《新獸藥研制管理辦法》，注冊環(huán)節(jié)有《獸藥注冊辦法》;生產(chǎn)環(huán)節(jié)有《獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號管理辦法》、《獸藥標(biāo)簽和說明書管理辦法》，并發(fā)布了口蹄疫疫苗相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);流通環(huán)節(jié)有《獸藥經(jīng)營質(zhì)量管理規(guī)范》、《獸用生物制品經(jīng)營管理辦法》;監(jiān)督環(huán)節(jié)有《獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽樣規(guī)定》。為進(jìn)一步確保疫苗質(zhì)量，農(nóng)業(yè)部還采取駐廠監(jiān)督、飛行檢查、批簽發(fā)等多種日常監(jiān)管方式。

1.2 企業(yè)自身要求 產(chǎn)品質(zhì)量是企業(yè)永恒的主題，是企業(yè)一切工作的基礎(chǔ)，是鞏固和擴(kuò)大市場份額的一大優(yōu)勢和重要法寶，是關(guān)系到企業(yè)生存和發(fā)展的頭等大事。企業(yè)在追求利潤最大化時(shí)，也要勇于承擔(dān)社會(huì)責(zé)任，因?yàn)樗梢运茉炱髽I(yè)形象，打造企業(yè)品牌價(jià)值，從而獲得長遠(yuǎn)效益。諸多事件證明忽略社會(huì)責(zé)任對企業(yè)效益的損失是無法估量的。

1.3 生物制品特殊性 由于口蹄疫疫苗本身的特性和安全防護(hù)方面的漏洞，在某些生物安全問題方面，也會(huì)出現(xiàn)造成不應(yīng)有的損失。概括起來主要有可能對研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)檢和質(zhì)量監(jiān)督等人員造成感染、對環(huán)境造成污染?？梢哉f口蹄疫從研制開發(fā)到產(chǎn)品的應(yīng)用，甚至可以延伸到應(yīng)用之后的一定時(shí)期，都存在著生物安全方面的因素與風(fēng)險(xiǎn)?？谔阋叩纳锇踩珕栴}直接或間接影響人類的生命健康安全，關(guān)注與重視口蹄疫的生物安全問題，不僅是提高和保障動(dòng)物的健康問題，更重要的是提高與保障全人類的生命健康、促進(jìn)社會(huì)的穩(wěn)定問題。

2 質(zhì)量控制措施

2.1 獸藥GMP 我國農(nóng)業(yè)部于1989年開始實(shí)施獸藥GMP，規(guī)定自2005年12月31日起，未取得《GMP合格證》的企業(yè)不得進(jìn)行藥品生產(chǎn)，自2012年2月1日起，各省級獸醫(yī)行政部門不再受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥GMP驗(yàn)收申請，全面GMP認(rèn)證及管理升級使生產(chǎn)企業(yè)的工藝設(shè)備和條件有了極大地改善。

2.2 過程控制

2.2.1 原輔料的質(zhì)量控制 口蹄疫疫苗生產(chǎn)重要原輔料有培養(yǎng)基、206佐劑、血清等。由于口蹄疫疫苗配制成分中有很多生物源性材料，例血清、動(dòng)物源性水解乳蛋白等，所以必須要求這些產(chǎn)品的供貨商提供外源病毒的檢驗(yàn)報(bào)告。歐盟的1999/104/EC官方指令明確要求檢測這些原料產(chǎn)品中是否含有牛海綿狀腦病病毒[1]。生物制品在接種后引起的不良反應(yīng)中，有相當(dāng)比例是由于生產(chǎn)過程中使用的原輔材料所致。根據(jù)原輔料的使用情況增加相應(yīng)的檢測項(xiàng)目，如微生物限度、熱原檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查等生物安全性質(zhì)控項(xiàng)目，以進(jìn)一步確保使用的安全性。因此，在疫苗制備中原輔料成分不再被看作是無活性的物質(zhì)[2]，生物制品生產(chǎn)用原輔料的理化性質(zhì)和安全性對生物制品的有效性和安全性有著直接的影響?！吨袊F藥典》二O一O年版三部新增血清及活疫苗外源病毒檢驗(yàn)項(xiàng)目，并通過組織培訓(xùn)、專項(xiàng)檢查、座談等多種形式進(jìn)一步落實(shí)該項(xiàng)工作，足見其重要性。

2.2.2 細(xì)胞與病毒培養(yǎng)工藝的質(zhì)量控制 相對轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)代，口蹄疫懸浮培養(yǎng)在對傳統(tǒng)工藝的革新與發(fā)展，主要的三個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，其一是對培養(yǎng)基的優(yōu)化，細(xì)胞由貼壁生長方式轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩a(chǎn)方式，這就需要選擇個(gè)性化的培養(yǎng)基，滿足其生產(chǎn)要求，并不斷對原有細(xì)胞株進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)馴化后，進(jìn)行逐級放大培養(yǎng);其二是懸浮培養(yǎng)過程的優(yōu)化，如培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速、溫度、溶解氧濃度(DO)、pH值、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞活力(大于等于95%)等指標(biāo)，通過細(xì)胞倍增時(shí)間和細(xì)胞計(jì)數(shù)來評估細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量，控制接毒時(shí)間(達(dá)到2×106個(gè)/mL);其三是反應(yīng)器的優(yōu)化，目前生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和控制的參數(shù)有溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、DO和pH值等物理環(huán)境參數(shù)，而如在線滅菌系統(tǒng)(SIP)自動(dòng)滅菌與定位清洗(CIP)清洗的全自動(dòng)生物反應(yīng)器、生物反應(yīng)器的自動(dòng)取樣與分析系統(tǒng)等，一些重要器件如耐高溫滅菌的隔膜閥的抗疲勞、抗膨脹性以及器件加工工藝與標(biāo)準(zhǔn)都需進(jìn)一步優(yōu)化;供氧方式、攪拌方式、熱傳遞也需進(jìn)一步探索。

2.2.3 純化濃縮工藝的質(zhì)量控制 口蹄疫滅活疫苗誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答，通常需要較大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起免疫副反應(yīng)，另外，伴隨病毒增殖而產(chǎn)生的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對于感染動(dòng)物的甄別亦帶來困難。因此，在滅活疫苗特別是多價(jià)苗生產(chǎn)中，為了保證免疫效果，降低疫苗使用劑量，減少接種引起的有害反應(yīng)，利于病毒抗原和成品苗的貯存，便于免疫和感染的鑒別，就必須對病毒抗原進(jìn)行濃縮純化。現(xiàn)在常用于大規(guī)模生產(chǎn)的純化濃縮方法是超濾和沉淀法，聚乙二醇6000(PEG 6M)或聚環(huán)氧乙烷(PEO)不僅可以達(dá)到理想的濃縮倍數(shù)，還可大大降低抗原收獲物中非病毒蛋白成分及含量。目前，在生產(chǎn)中用切向流超濾裝置或中空纖維過濾系統(tǒng)或震動(dòng)篩進(jìn)行濃縮[3]。然而，過濾材料的載流量小于等于100 ku時(shí)純化效果不好，而大于200 ku時(shí)146S的損失又大[4]。使用PEG純化時(shí)，能夠充分的去除來源于BHK21疫苗中引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)。沉淀的抗原用低速離心法獲得，也可用助濾劑進(jìn)行沉淀抗原的過濾，如鈣化的硅藻土，比離心法方便的多[5]。滅活抗原也能用PEO沉淀法有效地沉淀。PEG沉淀可充分除去變應(yīng)原成分，PEO可使FMDV濃縮達(dá)1000倍，從病毒收獲物中最少除去95%的雜蛋白質(zhì)[6]。我國口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)對滅活抗原進(jìn)行一系列澄清、濃縮與純化工藝處理，有效去除了各類非抗原蛋白和其他雜質(zhì)，確保了疫苗的效力和高安全性。

2.2.4 檢驗(yàn)過程的質(zhì)量控制 口蹄疫的各項(xiàng)技術(shù)檢測指標(biāo)在嚴(yán)格執(zhí)行《規(guī)程》的情況下，重點(diǎn)進(jìn)行了幾項(xiàng)檢驗(yàn)。采用蔗糖密度梯度法對FMDV抗原進(jìn)行146S測定，實(shí)現(xiàn)了定量添加抗原，改變疫苗質(zhì)量控制以“定性而非定量”的方式，確保了疫苗效力;采用凱氏定氮法對疫苗中雜蛋白含量進(jìn)行定量檢測，實(shí)現(xiàn)了對疫苗有效成份的客觀評價(jià);口蹄疫外殼蛋白大約為29 kD，按變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)條帶方法實(shí)現(xiàn)了對疫苗有效抗原和雜蛋白含量進(jìn)行簡便的評價(jià);按照《中華人民共和國獸藥典》二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對整個(gè)工藝進(jìn)行內(nèi)毒素的控制。

2.2.5 生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)督 質(zhì)量活動(dòng)必須貫穿于整個(gè)生產(chǎn)過程，以得到符合既定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品?？谔阋咭呙缟a(chǎn)從原料的進(jìn)廠到生產(chǎn)后檢驗(yàn)合格放行，涉及到許多工序和環(huán)節(jié)，在每個(gè)環(huán)節(jié)都必須把好質(zhì)量關(guān)，才能最終保證產(chǎn)品質(zhì)量，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的疏忽，都有可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不合格。因此，口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)根據(jù)自身產(chǎn)品的特點(diǎn)制訂合理的產(chǎn)品工藝，并結(jié)合設(shè)備特點(diǎn)制訂相應(yīng)的崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，明確生產(chǎn)流程和重點(diǎn)工序質(zhì)量監(jiān)控點(diǎn)，分工明確，要通過對生產(chǎn)過程的監(jiān)督和控制來保證產(chǎn)品的質(zhì)量。通過全員參與和有效的預(yù)防來減少生產(chǎn)過程中差錯(cuò)和污染，從而減少質(zhì)量事故的發(fā)生。

3 展望

2013年6月13日農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關(guān)于做好口蹄疫疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升工作的通知》，明確指出，在現(xiàn)有口蹄疫疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，提高效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，增加內(nèi)毒素和總蛋白檢測參數(shù):2013年9月1日起，新生產(chǎn)的口蹄疫滅活疫苗及合成肽疫苗效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)由每頭份3 PD50提高到6 PD50，新生產(chǎn)的口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素每頭份疫苗不超過50 EU;口蹄疫滅活疫苗總蛋白檢測參數(shù)分兩個(gè)階段實(shí)施，自2014年1月1日起，對總蛋白含量實(shí)施不定期抽樣檢測，并公開檢測結(jié)果，2015年1月1日起，總蛋白含量每毫升疫苗不高于500 ug。農(nóng)業(yè)部在提高口蹄疫疫苗抗原含量和內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，2015年開始將進(jìn)一步提高雜蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)。目前我國獸用疫苗中強(qiáng)制免疫苗品種較少但所占比重較大，而畜牧養(yǎng)殖規(guī)?；F(xiàn)代化將推動(dòng)整個(gè)行業(yè)需求結(jié)構(gòu)調(diào)整，向品質(zhì)化、多樣化方向發(fā)展。隨著上游畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的穩(wěn)定增長，必須免疫的強(qiáng)制免疫苗的需求將穩(wěn)中有升，同時(shí)相關(guān)產(chǎn)品的毒株改良、佐劑改良、工藝改進(jìn)(如懸浮技術(shù)的普遍使用)、質(zhì)量提升將是大勢所趨。由于我國強(qiáng)制免疫疫苗生產(chǎn)廠家數(shù)量較多，其在生產(chǎn)設(shè)備、技術(shù)力量、工藝水平等方面差別較大，國家采購標(biāo)準(zhǔn)的提高將加速行業(yè)優(yōu)勝劣汰，有利于優(yōu)勢企業(yè)市場集中度的提升。預(yù)計(jì)除口蹄疫疫苗外，未來高致病性禽流感、豬藍(lán)耳疫苗等其他強(qiáng)免疫苗的政府采購標(biāo)準(zhǔn)都有望進(jìn)一步提高。

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