郭桂芳，楊 星，董玲玲，徐 嫄，郝利華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

目前政府對(duì)獸藥市場(chǎng)制假、造假打擊力度日漸加深，而非法添加現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。筆者在對(duì)某企業(yè)某批次恩諾沙星注射液進(jìn)行監(jiān)督抽檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，除主成分外還發(fā)現(xiàn)處方外成分。隨即對(duì)該未知成分用HPLC-PDA法對(duì)其色譜行為和光譜行為進(jìn)行進(jìn)一步研究探討，通過與對(duì)照品保留時(shí)間及光譜圖的匹配度的比對(duì)，確證其中未知物為磺胺嘧啶，為處方外非法添加物，對(duì)此建立相應(yīng)的檢查方法[1-3]。本方法的建立為監(jiān)管部門執(zhí)法提供了技術(shù)依據(jù)，并為非法添加檢查方法的建立提供參考和借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 高效液相色譜儀Waters 2695，二極管陣列檢測(cè)器2998(PDA)，美國waters公司;精密天平AE240，精度0.01 mg，梅特勒精密儀器廠。

1.2 受試藥物 磺胺嘧啶對(duì)照品、磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品、磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品、磺胺喹噁啉對(duì)照品、磺胺氯達(dá)嗪鈉對(duì)照品，均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。恩諾沙星注射液:某市售產(chǎn)品，規(guī)格10 mL:0.5 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別檢查 采用《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部[4]恩諾沙星注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別(2)方法，色譜條件為:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.025 mol/L磷酸溶液(以三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0)，檢測(cè)波長278 nm。

結(jié)果見圖1、圖2。受試樣品色譜圖中檢出兩色譜峰，10.7min處與對(duì)照品色譜峰一致，為主成分恩諾沙星，4.763 min處峰為未知峰。

圖1 受試樣品色譜圖

圖2 恩諾沙星對(duì)照品色譜圖

2.2 HPLC-PDA篩查

2.2.1 HPLC-PDA色譜結(jié)果 將2.1項(xiàng)中將紫外檢測(cè)器改為PDA檢測(cè)器。對(duì)受試樣品按2.1項(xiàng)條件測(cè)定。結(jié)果見圖3。色譜圖中9.124 min處為恩諾沙星峰，其最大吸收波長為278 nm，7.111 min處為未知峰，最大吸收波長為267 nm。對(duì)未知峰進(jìn)行峰純度分析，見圖4，純度小于閾值。故未知峰為單一成分。其最大吸收波長與光譜圖特征與磺胺類藥物類似。

2.2.2 對(duì)照品對(duì)比試驗(yàn) 分別取各磺胺對(duì)照品適量，加0.1 mol/L氫氧化鈉試液10 mL使溶解，加流動(dòng)相稀釋至約0.1 mg/mL，按上述色譜條件，測(cè)定受試樣品中未知峰與各對(duì)照品色譜圖主峰保留時(shí)間是否一致，光譜圖是否匹配。結(jié)果見圖5、圖6?；前粪奏?duì)照品主峰保留時(shí)間與供試樣品未知峰保留時(shí)間一致;兩色譜峰最大吸收波長及光譜指數(shù)圖相匹配。

2.3 方法學(xué)考察及優(yōu)化

2.3.1 耐用性 流動(dòng)相比例改變:色譜柱采用Alltima C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，在藥典[4]規(guī)定范圍調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例。色譜分離表明，水相與有機(jī)相之比為78∶22時(shí)，兩峰分離度小于1.5，當(dāng)比例為88∶12時(shí)，恩諾沙星峰保留時(shí)間超過30 min，故選擇流動(dòng)相比例為83∶17。不同型號(hào)色譜柱的影響:采用不同型號(hào)C18柱，其他條件不變時(shí)，測(cè)定結(jié)果見表1。

圖3 供試樣品光譜圖與色譜圖

圖4 未知峰純度圖

圖5 磺胺嘧啶對(duì)照品和受試樣品色譜圖

圖6 磺胺嘧啶對(duì)照品和供試樣品7．1 min色譜峰匹配圖

表1 不同型號(hào)色譜柱對(duì)方法系統(tǒng)適用性的影響

上述三種型號(hào)色譜柱均能使恩諾沙星峰與磺胺嘧啶峰分開。

2.3.2 線性 取磺胺嘧啶對(duì)照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，精密量取 1、3、5、7、9 mL 于50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測(cè)定。按磺胺嘧啶峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

磺胺嘧啶回歸方程為y=873577x+98154，R2=1。表明磺胺嘧啶在20～180 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限 恩諾沙星儲(chǔ)備液:取恩諾沙星對(duì)照品25 mg，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL含0.5 mg/mL的溶液，備用。

檢測(cè)限溶液制備:取磺胺嘧啶對(duì)照品適量，加恩諾沙星儲(chǔ)備液1 mL于10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測(cè)定。光譜指數(shù)圖失真前的濃度為本法的檢測(cè)限，S/N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下磺胺嘧啶檢測(cè)限為 5 μg/mL，定量限為10 μg/mL。

2.3.4 準(zhǔn)確度 以磺胺嘧啶鈉注射液10 mL:1 g規(guī)格為100%，分別以80%、100%、120%進(jìn)行三個(gè)濃度各三平行添加回收，其中含恩諾沙星的量不變?；厥章式Y(jié)果見表2。

表2 磺胺嘧啶回收率結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果 用上述建立的HPLC-PDA法對(duì)該批恩諾沙星注射液進(jìn)行了磺胺嘧啶的含量測(cè)定，六份平行樣測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 恩諾沙星注射液中磺胺嘧啶含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

3 討論

目前對(duì)于獸藥非法添加仍然采取檢出何種添加物建立該成分的檢測(cè)方法，并以補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)予以發(fā)布，結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)該成分在不同產(chǎn)品中添加而建立一系列的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行一系列的方法學(xué)研究資料，造成大量重復(fù)性工作。筆者認(rèn)為建立一個(gè)比較完整的常見獸藥數(shù)據(jù)庫顯得更加尤為重要，發(fā)現(xiàn)問題產(chǎn)品時(shí)，通過直接與數(shù)據(jù)庫比對(duì)其光譜行為和色譜行為，來判斷處方外成分，即可大大縮短方法建立時(shí)間，可快速為獸藥監(jiān)管部門執(zhí)法提供有力的技術(shù)保障。而本文中所進(jìn)行的定性、定量研究手段可作為數(shù)據(jù)庫建立時(shí)方法建立的借鑒。

[1]郝利華，于曉輝，董玲玲，等.HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物[J].中國獸藥雜志，2012，46(8)，28-31.

[2]郝利華，畢言鋒，郭桂芳，等.HPLC-PDA法測(cè)定黃芪多糖注射液中非法添加利巴韋林的試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49(2)，76-78.

[3]吳小紅，李煥德.高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)分析測(cè)定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素[J].中南藥學(xué)，2009，7(5):324-327.

[4]中華人民共和國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典二○一○年版一部[S].