王麗紅, 陳世偉, 張 帥, 孔 陽

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

煙草赤星病由煙草赤星病菌引起,是世界各煙草產(chǎn)區(qū)煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一[1],在我國各煙區(qū)均有發(fā)生, 每年發(fā)病面積約占我國種植面積的30～35%，2007～2009年全國煙區(qū)因赤星病造成的產(chǎn)值損失達41 856.47萬元[2].近年來，對煙草赤星病菌的研究隨著煙草生產(chǎn)技術(shù)的改進,特別是施肥量的增加、嚴(yán)格規(guī)范掌握煙草采收成熟度,相應(yīng)地延長了煙株大田生長期,因而病害的發(fā)生及其危害程度呈上升趨勢,已成為優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)的重要障礙因素之一.目前主要采用化學(xué)防治為主的防治技術(shù)，但農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性以及對卷煙衛(wèi)生的影響,限制了農(nóng)藥的大規(guī)模利用.分離篩選出對赤星病菌具有良好抑制作用和防治效果的拮抗菌是實施生物防治的一項重要工作[3].近年來一些學(xué)者對此病害進行了生物防治研究[4-7],但真正應(yīng)用離實際生產(chǎn)還有較大的距離.因此，篩選出對煙草赤星病菌具有較強拮抗作用并應(yīng)用于煙草赤星病菌防治是亟需解決的問題，本文通過在煙草赤星病感染區(qū)、秦嶺山區(qū)采集的土壤樣品中分離純化，擬篩選出可以產(chǎn)生抗煙草赤星病原真菌抗生素的放線菌.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

煙草赤星病原真菌(Alternariaalternata(Fries)Keissler)、辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeon)、黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、蘋果輪紋菌(Macrophomakawatrukaii)、 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母由陜西科技大學(xué)制藥工程實驗室分離保存.

土壤樣品：采自煙草種植區(qū)煙草赤星病菌感染區(qū)的健康煙草植物根際及秦嶺山區(qū)海拔1 100～1 300 m森林中的土壤.

1.2 培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基(檢定菌培養(yǎng))，高氏一號培養(yǎng)基(放線菌篩選及保存).

(2)種子培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO30.1，NaCl 0.05，(NH4)2SO40.05,蒸餾水，pH7.0～7.5，115 ℃滅菌30 min.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉4.0，葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO30.1，(NH4)2SO40.05,K2HPO40.05,FeSO4·7H2O 0.001,玉米粉1.0，蒸餾水，pH7.0～7.5，115 ℃滅菌30 min.

1.3 實驗方法

(1)試驗步驟：

土壤樣品采集→土壤預(yù)處理→放線菌富集培養(yǎng)→平板初篩→抑菌率測定→發(fā)酵液復(fù)篩→其它病原菌抑制作用測定.

將采集土壤置于無菌平皿中風(fēng)干8天，稱取1 g風(fēng)干后的土樣,研缽內(nèi)研磨,土壤顆粒均勻即可.然后采用高氏一號液體培養(yǎng)基富集土壤中放線菌，同時加入100μg/mL重鉻酸鉀為抑制劑，進行30 ℃搖瓶富集培養(yǎng)，5 h后將土壤富集液10-1～10-3梯度稀釋，取0.1 mL稀釋液倒入平皿，傾注高氏一號培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)，挑取放線菌斜面保存.

(2)平板初篩及抑菌率測定

初篩采用平板對峙法[8], 在高氏一號培養(yǎng)基平皿上點接煙草赤星病菌和富集保存的放線菌斜面菌種，30 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察平皿中菌落生長狀況，根據(jù)檢定菌與平皿中的放線菌生長情況挑取有拮抗作用的菌落純化保存.

對有抑菌活性的菌種進行抑菌率測定，以煙草赤星病菌為中心，四周點接放線菌，每種菌做三個重復(fù)，并同時點接煙草赤星病菌作為空白，30 ℃培養(yǎng)，三天后測量被抑制的煙草赤星病菌平均直徑以及空白實驗中煙草赤星病菌的直徑.再根據(jù)公式計算抑菌率[9].

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

式中:對照菌落直徑-三天培養(yǎng)的煙草赤星病菌病原真菌直徑，mm；處理菌落直徑-三天培養(yǎng)的對峙檢定菌菌落直徑,mm.

(3)初篩放線菌發(fā)酵液抑菌活性復(fù)篩

采用擴散法[10]測定菌株發(fā)酵液抑菌活性.將煙草赤星病菌成熟孢子從斜面培養(yǎng)基洗孢子, 與冷卻到45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻,用吸管吸取12 mL倒成平板,凝固后放入自制的塑料管.將初篩抑菌率較高的放線菌斜面洗孢子后，接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 rpm搖瓶培養(yǎng)48 h后，種子培養(yǎng)液以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，發(fā)酵液于12 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液加入上述制作的塑料管中，每個塑料管點樣280μL,重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)3 d后,測量抑菌圈直徑,根據(jù)抑菌圈確定拮抗效果最好的菌株.

(4)對其它病原菌的抑制作用鑒定

將復(fù)篩抗菌活性較好的放線菌菌株分別采用擴散法檢測其發(fā)酵液對辣椒疫霉菌、黃瓜枯萎菌、蘋果輪紋菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母的抑菌活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 平板初篩

試驗土樣采自煙草種植區(qū)煙草赤星病菌感染區(qū)的健康煙草植物根際及秦嶺山區(qū)森林中的土壤.主要考慮在煙草赤星病菌感染區(qū)，未被感染的煙草可能是其根際土壤中含有某些抗菌活性物質(zhì).而秦嶺山區(qū)森林中的土壤，由于微生物菌群常年積累種類較為豐富，因此從這兩方面考慮采集土樣.試驗主要從土壤中篩選放線菌，一方面是因為放線菌是目前產(chǎn)生抗生素的主要來源，另一方面本實驗在前期篩選研究中，發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生拮抗作用的主要是放線菌，真菌和細(xì)菌較少.因此，主要分離能產(chǎn)生抗生素的放線菌.

通過平板對峙法，發(fā)現(xiàn)有49株放線菌到對煙草赤星病菌有不同強度的抑菌作用.將49株菌株進一步分離純化，有些菌落在初次對峙中有較好的抑制作用，但由于菌落不純，經(jīng)多次分離純化后有抑菌作用的菌株丟失，或由于培養(yǎng)條件影響抑菌作用不穩(wěn)定，經(jīng)多次重復(fù)平板對峙試驗，最終篩選到有穩(wěn)定抑制作用的菌株31株，分別以篩選時間及序號命名，部分對峙效果圖如圖1所示.

圖1 部分菌株對煙草赤星病菌病原真菌的抑菌作用(抑菌圈如圖所指)

2.2 抑菌率測定

為了準(zhǔn)確描述初篩菌株的抑菌效果,將31株菌株分別采用平板對峙法檢測其對煙草赤星病菌的抑菌強弱，采用三天培養(yǎng)后檢測，試驗結(jié)果抑菌率都較高，其中有19株抑菌率達到了20%以上，12株菌株抑菌率大于30%，具體數(shù)據(jù)如表1所示.

表1 19株菌對煙草赤星病菌病原真菌的抑菌率

2.3 發(fā)酵液抗菌活性復(fù)篩

將初篩抑菌率大于30%的12株菌株發(fā)酵，分別發(fā)酵48 h、72 h、96 h、120 h、144 h后檢測抑菌圈，試驗發(fā)現(xiàn)96 h和120 h的發(fā)酵液對檢定菌具有明顯抑菌作用，主要因為抗生素為次級代謝產(chǎn)物，在菌體進入穩(wěn)定期后才會大量合成，而且抗生素不穩(wěn)定進入衰退期易分解，而96 h和120 h時這幾株菌株發(fā)酵可能處于穩(wěn)定期，相比抗生素抑菌作用較強.因此主要測定96 h和120 h時發(fā)酵液對煙草赤星病菌抑菌作用，但也有3株菌株發(fā)酵液未檢測到抑菌作用，可能因為菌體培養(yǎng)后未產(chǎn)生抗生素而平板中的抑菌作用僅為菌體之間的拮抗作用，或者是抗生素不穩(wěn)定易分解導(dǎo)致，因此只有9株菌株檢測到發(fā)酵液的抑菌作用，結(jié)果如圖2所示，抑菌圈直徑檢測具體數(shù)據(jù)如表2所示.

圖2 發(fā)酵液對煙草赤星病菌抑菌效果

表2 發(fā)酵液對煙草赤星病菌抑菌圈效果

從表2中可以看出9株菌的發(fā)酵液都有一定的抑菌作用，由于真菌生長的蔓延性和試驗的誤差，菌落直徑檢測有一定的范圍，但基本能反應(yīng)抑菌圈的大小，其中Y26-2和Y82-2抑菌圈直徑較大且產(chǎn)生的抗生素物質(zhì)作用時效較長，不宜分解，相對較穩(wěn)定，因此是2株較好的對煙草赤星病菌病原真菌有抑制作用的菌株.

2.4 對其它病原菌的抑制作用鑒定

將Y26-2和Y82-2菌株分別采用擴散法檢測其培養(yǎng)96 h后發(fā)酵液對辣椒疫霉菌、黃瓜枯萎菌、蘋果輪紋菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母的抑菌活性.試驗結(jié)果顯示, Y26-2和Y82-2菌株代謝產(chǎn)物具有選擇性抑制作用效果,都對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母沒有抑制作用，對辣椒疫霉菌、黃瓜枯萎菌、蘋果輪紋菌植物病原真菌有一定抑菌作用，其中Y26-2對辣椒疫霉菌抑菌作用較強，Y82-2對黃瓜枯萎菌抑菌作用最弱.

3 結(jié)束語

通過平板對峙和發(fā)酵液擴散篩選最終篩選到2株放線菌Y26-2和Y82-2，能夠產(chǎn)生較穩(wěn)定的對煙草赤星病菌有較強抑制作用的抗生素.并且對辣椒疫霉菌、黃瓜枯萎菌、蘋果輪紋菌植物病原真菌有一定拮抗作用，能產(chǎn)生針對植物病原真菌的抗生素物質(zhì).但由于采樣點較少只能分離、純化到部分菌株，缺乏廣泛性，同時有關(guān)菌株的發(fā)酵工藝及代謝產(chǎn)物需要進一步深入試驗和研究.

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