劉 迪， 尚 華， 宋曉宇

(1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工與紡織學(xué)院， 陜西 咸陽 712000； 2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司， 陜西 西安 710100)

0 引言

根皮苷屬于多酚類物質(zhì)，分子式為C21H24O10, 為多酚物質(zhì)中植物黃酮類中的二氫查爾酮苷.根皮苷主要存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實(shí)中[1-5]， 具有多種生物活性[6-12]， 如調(diào)節(jié)血壓、血糖，保護(hù)心臟、清除體內(nèi)自由基及美白等，并且還具有低毒的特點(diǎn).目前，從植物中提取根皮苷的主要原料為蘋果植物，近年來在多穗柯植物中也發(fā)現(xiàn)了含量比較豐富的根皮苷[13,14].然而，在蘋果榨汁過程中，大部分多酚物質(zhì)隨果皮和果芯而轉(zhuǎn)移到果渣中，因此蘋果渣中含有較多的多酚物質(zhì)，其中含量較多的為根皮苷.

本研究以蘋果渣為原料，以根皮苷為分離純化對象，采用有機(jī)溶劑提取法制備粗提物，應(yīng)用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用響應(yīng)面[15-19]試驗(yàn)優(yōu)化方法研究最佳的分離條件，以期為蘋果渣深度加工和綜合利用提供參考，同時(shí)為尋找根皮苷的制備原料開辟一條新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣：由陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司提供，自然風(fēng)干后存放備用.

根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量>99.9%)，美國Sigma公司；甲醇、甲酸，色譜純；其它試劑均為分析純；D101樹脂，天津歐瑞生物科技有限公司.

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，日本島津公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；HL-2恒流泵，上海亞榮有限公司；離心機(jī)(TDL-5-A)，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5298A)，上海亞榮生化儀器廠；PB-10型精密酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果渣根皮苷粗提物的制備

將60%的乙醇溶液按照1∶10的料液比與蘋果渣粉混合，70 ℃恒溫水浴鍋中浸提5 h，浸提2次，過濾，合并濾液，離心分離，上清液為蘋果渣根皮苷粗提溶液.將粗提液減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉，并測定粗提物中根皮苷的含量.

1.3.2 根皮苷的測定

按照文獻(xiàn)[20]所示方法采用高效液相色譜法檢測各樣品中的根皮苷.將各樣品溶液濃縮，濃縮液經(jīng)過孔徑0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣測定根皮苷含量.

1.3.3 樹脂預(yù)處理

按照D-101型大孔吸附樹脂說明書所述方法，對樹脂進(jìn)行預(yù)處理及再生處理，待用.

1.3.4 樹脂吸附試驗(yàn)的響應(yīng)面法優(yōu)化

將經(jīng)過預(yù)處理后的D-101型大孔吸附樹脂裝入樹脂柱中，濕法裝柱，樹脂柱高高25 cm，內(nèi)徑2 cm.根據(jù)單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，確定試驗(yàn)因素及范圍，將吸附液濃度、吸附液pH和吸附流速作為動(dòng)態(tài)吸附的3個(gè)考察因素，每個(gè)因素為3個(gè)水平，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)以吸附率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析確定樹脂吸附的最佳條件.測定收集后的被吸附液中根皮苷含量，按照下式計(jì)算樹脂吸附率.

R1= [(C0V0-CeVe)/C0V0]× 100%

式中:R1為吸附率，%；C0為吸附液中根皮苷的濃度，mg /mL；V0為吸附液體積，mL；Ce為吸附后吸附液中根皮苷濃度,mg/mL；Ve為被吸附后的吸附液體積，mL.

1.3.5 樹脂洗脫試驗(yàn)的響應(yīng)面法優(yōu)化

按照1.3.4試驗(yàn)確定的最優(yōu)樹脂吸附條件進(jìn)行樹脂吸附試驗(yàn)，然后將樹脂用300 mL洗脫液按照不同的條件進(jìn)行洗脫.根據(jù)單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，確定試驗(yàn)因素及范圍，將乙醇洗脫液濃度、洗脫液pH和洗脫溫度作為動(dòng)態(tài)洗脫的3個(gè)考察因素，每個(gè)因素為3個(gè)水平，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)以洗脫率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析確定樹脂洗脫的最佳條件.測定收集后的洗脫液中根皮苷含量，按照下式計(jì)算樹脂洗脫率.

R2=[CDVD/(C0V0-CeVe)]×100%

式中:R2為洗脫率，%；CD為洗脫液中根皮苷濃度，mg/mL；VD為收集后的洗脫液體積，mL;VA為吸附液體積，mL；C0為吸附液中根皮苷的濃度，mg/mL；V0為吸附液體積，mL；Ce為吸附后吸附液中根皮苷濃度，mg/mL；Ve為被吸附后的吸附液體積，mL.

1.3.6 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Design-Expert 7.0軟件處理和分析試驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化樹脂吸附工藝的條件

按照三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各影響因素對吸附率影響的結(jié)果如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表2所示.

根據(jù)回歸分析，得出該模型因素實(shí)際值的二次回歸方程為：

R1=-11.17-129.95A+29.527 5B+98.34C+4.5AB-26.0AC-0.3BC+163.0A2-3.992 5B2-41.07C2

表1 樹脂吸附試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表2 樹脂吸附試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

注：**表示極顯著水平(P<0.01)

圖1 吸附各因素之間等高線和響應(yīng)面曲線

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，得出樹脂吸附蘋果渣粗提物的最佳操作條件為：吸附液濃度為0.5 mg/mL，吸附液pH為4，吸附流速為1.02 mL/min.在該最佳的吸附條件下，模型預(yù)測的最大吸附率可以達(dá)到70.94%.考慮到實(shí)際操作的可行性，將模型給出的最優(yōu)條件取整，即操作最優(yōu)條件為吸附液濃度0.5 mg/mL，吸附液pH4，吸附流速1.0 mL/min.在該實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測定3次，得到吸附率的平均值為69.87%，與模型給出的結(jié)果十分接近，表明該模型可信，可用于實(shí)際工藝參數(shù)確定的指導(dǎo).

根據(jù)回歸方程，繪制出兩兩交互作用對吸附率影響的等高線和響應(yīng)面曲線，如圖1所示.圖1表明，各因素之間交互作用不顯著.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化樹脂洗脫工藝條件

按照三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各影響因素對洗脫率影響的結(jié)果如表3所示，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表4所示.

表3 樹脂洗脫試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表4 樹脂洗脫試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

注：*表示顯著水平(P<0.05)；**表示極顯著水平(P<0.01).

圖2 洗脫各因素之間等高線和響應(yīng)面曲線

根據(jù)回歸分析，得出該模型因素實(shí)際值的二次回歸方程為：

R2=857.887 50+20.832 50A+45.937 50B-1.801 25C+0.032 5AB-0.003 75AC-0.01BC-0.132 75A2-3.4B2+0.012C2

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，得出樹脂洗脫的最佳操作條件為：乙醇濃度為79.05%，洗脫液pH為7.5，洗脫溫度69.92 ℃.在該最佳的吸附條件下，模型預(yù)測的最大洗脫率可以達(dá)到90.63%.考慮到實(shí)際操作的可行性，將模型給出的最優(yōu)條件取整，即操作最優(yōu)條件為乙醇濃度80%，洗脫液pH為7.5，洗脫溫度70 ℃.在該實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行測定3次，得到洗脫率的平均值為89.92%，與模型給出的結(jié)果十分接近，表明該模型可信，可以用于實(shí)際工藝參數(shù)確定的指導(dǎo).

根據(jù)回歸方程，繪制出兩兩交互作用對吸附率影響的等高線和響應(yīng)面曲線，如圖2所示.圖2表明，各因素之間交互作用不顯著.

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化方法蘋果渣中根皮苷大孔吸附樹脂分離工藝條件，得到了回歸方程，并確定大孔吸附樹脂最優(yōu)吸附條件為：吸附液濃度0.5mg/mL、吸附液pH值4、吸附流速1.0mL/min，在此條件下吸附率可達(dá)到69.87%，各因素對吸附率影響順序?yàn)椋何搅魉?吸附液pH>吸附液濃度；最優(yōu)洗脫條件為：乙醇洗脫液濃度80%、洗脫液pH值7、洗脫溫度70 ℃，洗脫率可達(dá)89.92%，各因素對洗脫率影響順序?yàn)椋合疵撘簆H>乙醇洗脫液濃度>洗脫溫度.

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