王麗紅， 孔 陽(yáng)， 馬衛(wèi)紅， 宇文亞煥

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

姬松茸又名巴西蘑菇，別名小松菇，是一種美味兼藥用的蘑菇，在真菌分類上屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類.近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)姬松茸子實(shí)體中含有抗腫瘤多糖、凝聚素、甾醇、核酸等生理活

性成分,在治療癌癥、糖尿病、高血脂、慢性肝炎等方面也具有顯著的醫(yī)療保健作用，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的珍貴食藥用真菌[2-4].姬松茸發(fā)酵菌絲體由于具有與子實(shí)體相似的營(yíng)養(yǎng)成分、藥理成分和保健功效[5-7]，并且采用深層液體發(fā)酵具有相對(duì)周期短、成本低、可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì),因此是目前食藥用真菌實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的主要方式.近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外主要側(cè)重研究菌絲體中的活性多糖的提取工藝，但有關(guān)如何通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化提高菌絲體胞內(nèi)多糖產(chǎn)量這方面的報(bào)道還不多.為此，本試驗(yàn)主要以姬松茸的菌絲生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為考察指標(biāo)，對(duì)姬松茸的深層液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，為今后姬松茸多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ).

我國(guó)幅員遼闊，自然優(yōu)越，蘊(yùn)藏極為豐富的中草藥植物資源，有學(xué)者提出中藥中某些營(yíng)養(yǎng)成分可促進(jìn)藥用真菌的生長(zhǎng)或活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而制得藥效更佳的新型發(fā)酵制劑[8].中草藥的某些成分可能使姬松茸的原有作用得到補(bǔ)充或增強(qiáng), 因此，本文在發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上通過(guò)添加8種中草藥提取液，研究對(duì)姬松茸菌絲體多糖產(chǎn)量的影響，以便于進(jìn)一步制作出配伍更佳的新型復(fù)合發(fā)酵制劑,用于功能性食品的開(kāi)發(fā).

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌種

姬松茸(AgaricusblazeiMussel)

陜西省微生物研究所提供.

1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯浸出液20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2PO40.2%, MgSO4·7H2O 0.1%.

(2)搖瓶種子培養(yǎng)基:馬鈴薯浸出液20%，葡萄糖2%，KH2PO40.2%, MgSO4·7H2O 0.1%，Vb110 mg/100 mL.

(3)搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:玉米粉2.5%,酵母膏0.3%,KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.2%, Vb110 mg/100 mL,pH為5.0左右.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 姬松茸菌絲體培養(yǎng)

將活化好的斜面菌種用接種鏟切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)4 d后以10%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶.250 mL搖瓶裝液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定姬松茸菌絲體干重和胞內(nèi)多糖含量.

(1)在發(fā)酵過(guò)程中分別考察碳源、氮源、裝液量及培養(yǎng)溫度對(duì)姬松茸菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響.

(2)并在此基礎(chǔ)上考察不同中草藥及中草藥互配對(duì)姬松茸菌絲多糖產(chǎn)量的影響.

不同條件各做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值.

1.3.2 檢測(cè)方法及中草藥提取液的制備

(1)姬松茸菌絲生物量測(cè)定:將100 mL發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心25 min后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗菌絲濾餅3次，將其置于90 ℃電熱恒溫干燥箱中，烘干至恒重，用分析天平稱重.

(2)多糖含量測(cè)定:準(zhǔn)確稱取干菌絲粉1.0 g，過(guò)孔徑0.154 mm篩，于150 mL三角瓶中加蒸餾水25 mL，90 ℃浸提3 h，3 000 r/min離心5 min，取上清液，此操作重復(fù)1次，將2次浸提液混合，用Sevag法去除蛋白質(zhì)后過(guò)濾，將濾液定容于50 mL容量瓶中，用苯酚-硫酸法[9]測(cè)定姬松茸總糖含量，DNS色法[10]測(cè)定姬松茸還原糖含量.

多糖含量=總糖含量-還原糖含量.

多糖產(chǎn)量=多糖含量×菌絲生物量.

(3)中草藥浸汁制備:

分別裝入100 mL三角瓶中于4 ℃冰箱保藏，用時(shí)取出加入發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行實(shí)體滅菌.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4及1.6 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色試管中，用苯酚-硫酸法于489 nm測(cè)定各管的吸光度.結(jié)果如圖1所示.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

確定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.011 1x+0.023 2(x表示葡萄糖濃度，y表示吸光度)R2=0.991 7.

2.2 不同碳源對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別調(diào)整碳源為淀粉、蔗糖、玉米粉和葡萄糖各2.5%，250 mL搖瓶瓶裝液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，菌絲生物量和多糖產(chǎn)量結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同碳源對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知，姬松茸對(duì)碳源利用比較廣泛，對(duì)各種碳源均能較好的利用.以玉米粉作碳源時(shí)，姬松茸菌絲體和多糖產(chǎn)量均較高，而且發(fā)酵液清亮，溶氧率高，易過(guò)濾，價(jià)格比較低廉，所以本試驗(yàn)中選玉米粉為最佳碳源.

2.3 氮源對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

調(diào)整搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基各種氮源酵母膏、蛋白胨、豆餅粉和硫酸銨各0.3%， 250 mL搖瓶裝液量40 mL，于25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d， 發(fā)酵結(jié)束考察各種氮源對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響.結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同氮源對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

由圖3可知，姬松茸對(duì)有機(jī)氮源的利用總體上優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，菌絲生物量和多糖產(chǎn)量都明顯高于無(wú)機(jī)氮源.以酵母膏、蛋白胨和豆餅粉作氮源時(shí)，姬松茸菌絲體多糖產(chǎn)量都較高，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，豆餅粉具有更大的優(yōu)勢(shì)，所以在本試驗(yàn)中以豆餅粉作為最佳氮源.

2.4 搖瓶裝液量對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

250 mL搖瓶裝液量分別為30、40、50、60和70 mL，于25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，考察搖瓶裝液量對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響.結(jié)果如圖4所示.

圖4 搖瓶裝液量對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

由圖4可知，搖瓶裝液量對(duì)菌絲體生物量有較大的影響，裝液量為50 mL時(shí)，菌絲生物量和多糖產(chǎn)量均較大.裝液量小時(shí)，由于該菌種的培養(yǎng)周期太長(zhǎng)，后期培養(yǎng)基會(huì)蒸發(fā)，從而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足影響菌絲生長(zhǎng)；當(dāng)裝液量增大時(shí)，會(huì)影響通風(fēng)量導(dǎo)致供氧不足，菌絲生物量和多糖產(chǎn)量均減少.因此，在本試驗(yàn)中，選擇250 mL三角瓶裝液量為50 mL進(jìn)行發(fā)酵.

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

250 mL搖瓶瓶裝液量為40 mL，分別20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，考察發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響.結(jié)果如圖5所示.

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生物量和多糖產(chǎn)量的影響

從圖5可知，溫度過(guò)大過(guò)小都不利于菌體生長(zhǎng)和多糖的形成，因此確定26 ℃為最佳發(fā)酵溫度.

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件

通過(guò)上述單因子實(shí)驗(yàn)，分別選定碳源玉米粉(A)、氮源豆餅粉(B)、裝液量(C)和溫度(D)4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)正交表L9(34)，從而確定最佳培養(yǎng)條件.結(jié)果如表1所示.

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由正交設(shè)計(jì)多糖產(chǎn)量的結(jié)果可見(jiàn)，各種培養(yǎng)因素對(duì)多糖產(chǎn)量的影響依次為發(fā)酵溫度對(duì)該菌株的多糖產(chǎn)量影響最大，碳源次之，裝液量對(duì)多糖產(chǎn)量的影響較低，氮源影響最小.確定不同因素的最佳組合為A2B2C1D2，即玉米粉3%、豆餅粉0.3%、裝液量45 mL和發(fā)酵溫度25 ℃.在此發(fā)酵條件下，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到7.26 g/L.

2.7 不同中草藥對(duì)姬松茸菌絲多糖產(chǎn)量的影響

在優(yōu)化后的最佳因素條件下的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中依次添加3%的枸杞、山藥、黃芪、當(dāng)歸、黨參、生地黃、槐米、甘草8種中草藥濃縮液，250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種量為10%，pH自然，于25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，其結(jié)果如圖6所示：

圖6 各種中草藥對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量的影響

從圖6可以看出在添加3%的8種中草藥濃縮液時(shí)，姬松茸菌絲多糖產(chǎn)量有不同程度的變化，其中能夠提高多糖產(chǎn)量的中草藥及影響強(qiáng)弱依次為：生地黃>當(dāng)歸>槐米，而枸杞、山藥、黃芪、黨參、甘草對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量有抑制作用.最終在生地黃的影響下，多糖產(chǎn)量可達(dá)7.83 g/L.

2.8 中草藥互配對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量影響

將生地黃、當(dāng)歸、槐米3種中草藥濃縮液以總濃度3%的加量進(jìn)行均等配比，依此添加到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，研究中草藥協(xié)同作用對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量影響.結(jié)果如圖7所示.

圖7 中草藥互配對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量影響

從圖7中可知此次選擇的三種中草藥對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量沒(méi)有復(fù)方、協(xié)同作用，產(chǎn)量相比單獨(dú)添加生地黃有所下降.有關(guān)中草藥的協(xié)同促進(jìn)作用還應(yīng)擴(kuò)大篩選范圍，并根據(jù)姬松茸自然生長(zhǎng)環(huán)境周圍的中草藥種類篩選到能與姬松茸相互促進(jìn)的天然中草藥資源.

3 結(jié)束語(yǔ)

(1)菌絲生物量和胞內(nèi)多糖含量存在不平行性，生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高，多糖產(chǎn)量是考慮的最終因素.

(2)影響姬松茸多糖和生物量的因素較多，本試驗(yàn)僅對(duì)主要影響因素進(jìn)行研究，確定最佳培養(yǎng)條件：玉米粉3%、豆餅粉0.3%、250 mL搖瓶裝液量45 mL，發(fā)酵溫度25 ℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，在此發(fā)酵條件下，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到7.26 g/L.

(3)利用天然中草藥結(jié)合姬松茸制作出配伍更佳的新型復(fù)合發(fā)酵制劑，目前已用于功能性食品的開(kāi)發(fā).本試驗(yàn)通過(guò)8種中草藥的添加發(fā)現(xiàn)生地黃對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量有一定的提高作用，多糖產(chǎn)量可達(dá)7.83 g/L.但生地黃、當(dāng)歸、槐米3種中草藥互配對(duì)姬松茸多糖產(chǎn)量沒(méi)有明顯協(xié)同促進(jìn)作用.有關(guān)中草藥的藥理作用還需進(jìn)一步研究.

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