祖立闖 ，王金良 ，肖躍強 ，沈志強 ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）又名兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的兔的一種急性、高度致死性、高度傳染性疾病，其發(fā)病率和致死率都很高，是危害養(yǎng)兔業(yè)和實驗兔的一種烈性、毀滅性傳染?。?－3］。該病于1984年春在江蘇無錫、江陰等縣市首次暴發(fā)，現(xiàn)在已蔓延至世界各地，呈世界性分布，給全球養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［4－8］。世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為二類動物疫病。由于RHDV在體外組織細胞的培養(yǎng)方法尚未建立，現(xiàn)行RHD的診斷和預(yù)防制劑一直利用來自感染兔的肝臟組織，成本高，抗原不易純化，也不符合動物福利的要求。目前，研究者更傾向于利用分子生物學(xué)手段進行新型診斷試劑及疫苗的研制和開發(fā)。VP60為病毒衣殼蛋白，是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，與誘導(dǎo)抗病毒感染免疫反應(yīng)直接相關(guān)，是病毒免疫保護性抗原［9－11］。鑒于此，本研究對 VP60基因主要抗原區(qū)域（長度為510 bp）進行了截短表達，并研制了間接ELISA診斷試劑盒。

1 材料與方法

1.1 菌株、病毒與血清

克隆菌株DH5α、表達菌株BL21、表達載體PGEX－4T－1、RHDV毒株及參考陽性、陰性血清，均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院實驗室保存。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T克隆載體及限制性內(nèi)切酶，購自寶生物（大連）工程有限公司；山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體，購自上海研卉生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的RHDV基因組序列，利用oligo6.2設(shè)計合成了 1對特異性引物：P1 5’-3’CCGGAATTCGAGGGCAAAACC CGCAC；P2 5’-3’CCGCTCGAGT TGGGACGCAAGTCTGG。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取

將兔瘟肝臟組織毒反復(fù)凍融3次，經(jīng)3 000 r/min離心15 min，吸取上清作為病毒液，按Trizol試劑使用說明提取病毒基因組RNA。

1.5 VP60基因的RT-PCR擴增

以提取的病毒基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ l min、58℃ l min、72℃ l min，共進行30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取擴增產(chǎn)物5 μL，在10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步鑒定。

1.6 VP60基因表達載體的構(gòu)建與鑒定

利用EcoRI/XhoI雙酶切VP60，回收VP60基因片段，定向克隆到經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切的PGEX-4T-1表達載體中，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR及EcoRI/XhoI雙酶切鑒定后獲得重組表達載體PGEX-VP60。將鑒定為陽性的克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序，以驗證其閱讀框架。

1.7 VP60重組蛋白的表達與純化

將鑒定正確的PGEX-VP60重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21感受態(tài)細胞誘導(dǎo)表達后，超聲破碎細胞，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清及沉淀進行SDS-PAGE分析，對以包涵體形式存在于沉淀中的重組蛋白用尿素進行變性處理，包涵體溶解后采用親和層析法純化，純化后的蛋白進行透析復(fù)性。

1.8 VP60重組蛋白的Western blot檢測

純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加RHDV陽性血清（1∶100稀釋）37℃作用1 h，TBST緩沖液洗3次；加入山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（1∶5 000稀釋）,37℃作用50min，TBST緩沖液洗3次，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液中顯色10min。

1.9 RHDV間接ELISA診斷方法（VP60-ELISA）的建立

1.9.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在相同反應(yīng)條件下，分別將重組抗原的不同稀釋度與血清的不同稀釋度、不同封閉液與不同封閉時間、酶標(biāo)二抗不同稀釋度與不同作用時間組成方陣滴定試驗，以陽性血清OD450nm≈1.0、陰性血清OD450nm＜0.2、陽性血清/陰性血清（P/N值）最大為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定重組抗原最佳包被濃度與血清樣品最佳稀釋度、最佳封閉液與最佳封閉時間、酶標(biāo)二抗最佳稀釋度與最佳作用時間。在相同反應(yīng)條件下，血清樣品分別作用 30、60、90、120min，TMB 底物液分別顯色 5、10、15、20 min，以陽性血清 OD450nm≈1.0、陰性血清OD450nm＜0.2、P/N值最大為選擇標(biāo)準(zhǔn)，分別確定血清、底物的最佳作用時間。

1.9.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 在最佳反應(yīng)條件下，利用VP60-ELISA檢測48份已知RHDV陰性血清樣本，以樣品號為橫坐標(biāo)、OD450 nm值為縱坐標(biāo)，繪制陰性樣品OD450 nm數(shù)值分布圖，并計算出48份陰性血清的OD450 nm平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），本試驗規(guī)定樣本OD450 nm≥+3SD時為陽性，樣本OD450 nm＜+2SD時為陰性，當(dāng)+2SD≤樣本OD450 nm＜+3SD時為可疑，需重新檢測樣本，重新檢測時樣本OD450 nm≥+2SD時判為陽性，樣本OD450 nm＜+2SD時判為陰性。

1.9.3 敏感性試驗 將RHDV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清分別按 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600比例稀釋，每個稀釋度平行做4個重復(fù)，用建立的RHDV VP60-ELISA檢測，測定OD450 nm值，判定其抗體效價。

1.9.4 重復(fù)性試驗 ①批內(nèi)重復(fù)性。選取6份RHDV抗體水平不同的血清，進行RHDV VP60-ELISA檢測，每份血清平行做6個重復(fù)，對結(jié)果進行分析。②批間重復(fù)性。選取6份RHDV抗體水平不同的血清，于4個不同時間用RHDV VP60-ELISA進行檢測，對結(jié)果進行分析。

1.10 臨床應(yīng)用

應(yīng)用研制的RHDV VP60-ELISA對來自河南、山東、河北等地的426份兔血清樣本進行檢測，確定上述地區(qū)RHDV血清抗體的陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV VP60基因的PCR擴增及其表達載體的鑒定

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約510 bp處可見特異性DNA擴增條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的PGEX-VP60重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及EcoRI/XhoI雙酶切鑒定（圖2）后，測序結(jié)果表明其閱讀框正確。

圖1 PCR擴增結(jié)果

圖2 重組表達載體酶切鑒定

2.2 VP60重組蛋白的表達及純化

以最佳條件對PGEX－VP60誘導(dǎo)表達后，超聲破碎細胞，可見目的蛋白大部分以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)8 mol/L尿素變性、親和層析法純化后，獲得了分子質(zhì)量為42ku的VP60重組蛋白（圖3）。

圖3 重組蛋白的SDS－PAGE分析

2.3 VP60重組蛋白的活性鑒定

取純化后的VP60重組蛋白，經(jīng)SDS－PAGE分析后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，與RHDV陽性血清作用，結(jié)果表明該重組蛋白能與RHDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而空載體表達菌與RHDV陽性血清沒有反應(yīng)（圖4）。

圖4 表達產(chǎn)物的免疫印跡分析

2.4 RHDV VP60－ELISA檢測條件的確定

2.4.1 最佳反應(yīng)條件 重組抗原的最佳包被濃度為5.88 μg/mL；最佳封閉液為含 10 g/L BSA 的 PBST，最佳封閉時間37℃1 h；血清最佳稀釋度1∶100，最佳作用時間為37℃1 h；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度1∶4 000，最佳作用時間37℃1h；底物最佳顯色時間37℃10min。

2.4.2 判定標(biāo)準(zhǔn) 48份陰性血清樣本經(jīng)RHDV VP60－ELISA檢測后，以樣品編號為橫坐標(biāo)、OD450 nm值為縱坐標(biāo)，得到陰性樣品OD450 nm數(shù)值分布圖（圖5）。計算得出48份陰性樣本OD450nm平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為x＝0.224和SD＝0.058。即當(dāng)樣本OD450 nm≥0.398時判為陽性；當(dāng)樣本OD450nm＜0.340時判為陰性；當(dāng)0.340≤樣本OD450nm＜0.398時判為可疑。對可疑樣本必須重新檢測，重新檢測時，樣本OD450 nm≥0.340為陽性。

圖5 RHDV VP60－ELISA檢測48份陰性樣品OD450 nm分布圖

2.5 敏感性

用建立的RHDV VP60－ELISA檢測RHDV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清，當(dāng)血清稀釋至12 800倍時，檢測結(jié)果仍為陽性（圖6），證明所建立的方法具有較好的敏感性。

圖6 RHDV VP60-ELISA敏感性試驗結(jié)果

2.6 重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性試驗樣品的變異系數(shù)小于4.9%；批間重復(fù)性試驗樣品的變異系數(shù)均小于6.9%。說明RHDV VP60-ELISA具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床應(yīng)用結(jié)果

應(yīng)用研制的RHDV VP60-ELISA試劑盒檢測了來自河南、山東、河北等地的426份血清樣本，檢測出陽性352份、陰性74份，陽性率82.6%。

3 討論

RHD是對兔威脅最嚴重的一種病毒性傳染病，常予兔群以毀滅性打擊，危害性極大，是養(yǎng)兔業(yè)和實驗用兔必檢病毒之一，檢測要求血清抗體必須達到保護性水平，才可以安全地用于生產(chǎn)和實驗。隨著我國養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展及實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化程度的普及和提高，RHD診斷方法的建立和標(biāo)準(zhǔn)化不可或缺。目前常用的RHDV抗體檢測方法是血凝抑制試驗（HI），需要人“O”型紅血球，血清需經(jīng)過吸附處理，過程較為繁瑣；結(jié)果判定易受許多主、客觀因素的影響，所以在實際應(yīng)用中受到很多限制。而ELISA診斷方法具有特異性和敏感性強、快速、準(zhǔn)確、通量高等特點，是動物傳染病檢疫、免疫抗體水平監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查廣泛采用的診斷技術(shù)。目前RHDV所用疫苗和診斷試劑均來源于感染兔的肝臟組織，獲得純度較高的病毒比較困難。同時這種組織毒抗原制備過程繁瑣、成本高、存在潛在的危險性及不符合動物福利的要求，一定程度上限制了全病毒間接ELISA檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化。因此，利用基因工程表達的人工抗原已逐步得到重視。VP60是RHDV唯一結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒免疫保護性抗原，在RHDV診斷、新型疫苗的研制中具有十分重要的意義。為此，本試驗利用PGEX-4T-1原核表達載體，表達了RHDV的VP60蛋白，經(jīng)免疫印跡試驗證實所截短表達的重組VP60蛋白具有良好的反應(yīng)性與特異性，并以該蛋白為包被抗原建立了檢測RHDV抗體的VP60-ELISA診斷方法。

目前，國內(nèi)各兔場均將兔瘟作為重點免疫疫病，作為重點防范的疫病之一，多年來未曾見大疫情流行報道，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)RHDV的平均抗體陽性率高達82.6%，說明我國現(xiàn)行兔瘟疫苗效果較好，但仍存在個別兔場免疫失敗的現(xiàn)象?？傊?，本試驗所表達的重組VP60蛋白具有良好的反應(yīng)活性，以其作為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法具有很好的敏感性和特異性，顯示出了良好的應(yīng)用前景。本實驗室預(yù)期將其組裝成試劑盒，為我國RHDV的診斷、疫苗免疫水平監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查、實驗兔等級檢測等提供一種簡便、快速的血清學(xué)檢測方法。

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