康曉魁 李佳 王海寧 張振 韓玉慶 張建寧 楊樹(shù)源 楊新宇

海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞下層（SGZ）與側(cè)腦室室管膜下區(qū)（SVZ）是神經(jīng)元生成的主要部位，在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命周期中，始終有新的神經(jīng)元生成，只是在成年時(shí)保持相當(dāng)?shù)偷乃?，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，新生神經(jīng)元的數(shù)量亦逐漸減少。神經(jīng)元生成的過(guò)程包括多能干細(xì)胞的增殖、分化、遷移和成熟，并受多種內(nèi)源性和外源性因素的調(diào)節(jié)，包括遺傳因素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、蛋白激酶和應(yīng)激等[1]。近年的研究表明，在發(fā)育過(guò)程中，堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因（basic Helix-Loop-Helix genes，bHLH genes）表達(dá)于海馬齒狀回中的神經(jīng)前體細(xì)胞中，同時(shí)在成年神經(jīng)元生成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2-3]，Neurogenin2（Ngn2）作為原神經(jīng)bHLH基因，其對(duì)海馬齒狀回中神經(jīng)元生成的作用還不清楚，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究。本文為了研究Ngn2在成年神經(jīng)元生成過(guò)程中的作用，以神經(jīng)元生成非?；钴S的新生小鼠（10 d）為對(duì)照，檢測(cè)成年小鼠中Ngn2的表達(dá)，以期初步闡述Ngn2的表達(dá)與成年神經(jīng)元生成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將C57BL/6雄性小鼠分為幼年組（7 d）和成年組（4個(gè)月），每組6只，成年小鼠于動(dòng)物室飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 Brdu給藥方法與腦片標(biāo)本制備 全部小鼠接受腹腔注射Brdu 3 d，2次/d，于最后一次注射后2 h予水合氯醛麻醉，常規(guī)灌注、斷頭取腦，入4%多聚甲醛固定過(guò)夜，然后于20%蔗糖脫水至標(biāo)本沉底。選擇海馬部位應(yīng)用冰凍切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，腦片厚度為35 μm，每隔140 μm取一張腦片。將腦片放入防凍液中保存以備用。

1.3 免疫熒光染色 通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)Ngn2、Brdu、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體步驟如下：將腦片于PBS中洗3次（5 min/次），后轉(zhuǎn)入1 mol/L的HCL，在45 ℃下進(jìn)行DNA變性半小時(shí)（只有含Brdu的染色才進(jìn)行此步驟），恢復(fù)到室溫后，再次用PBS洗3次（5 min/次），后轉(zhuǎn)入檸檬酸鈉中，80 ℃下抗原修復(fù)半小時(shí)，待其恢復(fù)到室溫，繼續(xù)PBS洗3次（5 min/次），然后在適量封閉液中室溫下?lián)u床1 h。吸去原有封閉液，再次加入封閉液，依次按比例加入一抗，完畢后放入4 ℃冰箱24～48 h。取出腦片，恢復(fù)到室溫后繼續(xù)PBS洗3次（5 min/次），轉(zhuǎn)入0.3%Triton中，避光條件下，分別按比例加入二抗，37 ℃搖床1 h，PBS洗3次（5 min/次），避光鋪片、甘油封片。最后在熒光顯微鏡下觀察腦片。

1.4 結(jié)果分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 400倍光鏡下觀察小鼠齒狀回顆粒細(xì)胞下層Brdu與Ngn2雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以及Ngn2與其他細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)。每只小鼠隨機(jī)選取6個(gè)非連續(xù)的腦片進(jìn)行Ngn2/Brdu雙陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，使用SPSS 10.0軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Ngn2的表達(dá)部位 新生小鼠海馬齒狀回尚處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，與成年小鼠相比，有更多的神經(jīng)元生成。Brdu可經(jīng)細(xì)胞分裂而整合入新生的細(xì)胞DNA中，故Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量就大致代表了新生神經(jīng)元的數(shù)量，從結(jié)果中可以看到新生小鼠的神經(jīng)元生成水平明顯高于成年小鼠，見(jiàn)圖1 A和E（封三）；同時(shí)，通過(guò)對(duì)Ngn2進(jìn)行免疫熒光染色，其表達(dá)水平與Brdu相一致，且只局限于SGZ，分別以單個(gè)、成對(duì)、成簇的方式存在，見(jiàn)圖1 B和F（封三）。為了進(jìn)一步對(duì)Ngn2陽(yáng)性細(xì)胞定性，筆者還進(jìn)行了未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物DCX與成熟神經(jīng)元標(biāo)記物Neun的染色，但是，Ngn2既不與DCX合并表達(dá)，見(jiàn)圖2（封三），亦不表達(dá)于成熟神經(jīng)元（NeuN陽(yáng)性細(xì)胞）。

2.2 Ngn2+/Brdu+細(xì)胞數(shù)的比較 Ngn2與Brdu的合并染色表明，只有部分Brdu陽(yáng)性細(xì)胞與Ngn2陽(yáng)性細(xì)胞重合，但是幾乎所有Ngn2陽(yáng)性細(xì)胞共同表達(dá)Brdu，見(jiàn)圖1 C和H（封三）。通過(guò)對(duì)各層面腦片的細(xì)胞計(jì)數(shù)，新生小鼠中雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于成年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1與圖3（封三）。

3 討論

上世紀(jì)60年代，成年哺乳動(dòng)物中神經(jīng)元的生成已經(jīng)是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)。Ngn2作為一種bHLH的原神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子，受Hes1的雙重調(diào)節(jié)：當(dāng)Hes1處于波動(dòng)表達(dá)狀態(tài)，那么Ngn2亦呈低水平的波動(dòng)表達(dá)，此時(shí)，Hes1與Ngn2共同維持著神經(jīng)干/祖細(xì)胞增殖狀態(tài)；而當(dāng)Hes1表達(dá)被抑制，則Ngn2表達(dá)增加，介導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖及向神經(jīng)元方向分化[4]。所以，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，其對(duì)腦與脊髓的發(fā)育有至關(guān)重要的作用[5]，甚至可作為海馬神經(jīng)前體細(xì)胞的分子標(biāo)記物[6]。有研究表明，隨著年齡的增加，神經(jīng)元生成水平逐漸下降[7]，C57/BL6小鼠在出生后的前7天，DG增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，7～14 d為快速增長(zhǎng)期，而后增長(zhǎng)速度再次減緩，到3個(gè)月趨于穩(wěn)定[8]，所以，幼年小鼠齒狀回顆粒細(xì)胞下層的神經(jīng)元生成亦處于活躍期。本實(shí)驗(yàn)中，筆者證實(shí)了幼年小鼠齒狀回Brdu陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于成年小鼠，說(shuō)明幼年小鼠神經(jīng)元生成的數(shù)量顯著多于成年小鼠。體外實(shí)驗(yàn)表明，Ngn2單一的過(guò)表達(dá)即可引起神經(jīng)干細(xì)胞向谷氨酸能神經(jīng)元方向分化、成熟[9]，而在齒狀回的發(fā)育過(guò)程中它的缺失則引起齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化障礙及齒狀回結(jié)構(gòu)與功能的異常[10]。因此，筆者推測(cè)Ngn2在幼年與成年小鼠中的表達(dá)差異，導(dǎo)致了神經(jīng)元生成水平的不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼年小鼠Ngn2的表達(dá)明顯高于成年小鼠，并且幼年小鼠中Brdu與Ngn2雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于成年小鼠（P<0.01）。同時(shí)，筆者還進(jìn)行了Ngn2與DCX、Neun的雙染色，發(fā)現(xiàn)Ngn2并不表達(dá)于未成熟神經(jīng)元（DCX+，圖2）及成熟神經(jīng)元（NeuN+，結(jié)果未顯示），且Ngn2的表達(dá)只局限于齒狀回的顆粒細(xì)胞下層，說(shuō)明Ngn2可能只表達(dá)于增殖狀態(tài)下的神經(jīng)前體細(xì)胞，而不表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞（GFAP+細(xì)胞）[11]及已定型的神經(jīng)前體細(xì)胞（DCX+細(xì)胞）。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，正是其短暫的表達(dá)才介導(dǎo)了神經(jīng)前體細(xì)胞退出細(xì)胞有絲分裂周期而向神經(jīng)元方向分化[10]。由此筆者可初步認(rèn)為，Ngn2在成年個(gè)體中的低表達(dá)直接或間接引起了新生神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，但是其在成年神經(jīng)再生中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究，比如在某些損傷因素下（腦缺血、腦外傷等），Ngn2的表達(dá)是否發(fā)生變化及影響神經(jīng)元的生成；通過(guò)上調(diào)或抑制Ngn2的表達(dá)研究其對(duì)神經(jīng)元生成的作用，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)具有重要意義。

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