梁漢彰

結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗和分型

梁漢彰

目的 探討結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗和分型。方法 采用瓊脂糖凝膠的電泳和PCR技術, 選取200株結(jié)核分枝桿菌六個能夠變化的重復點進行檢測, 使用Version3.0及Gel-Proanalyzer3.0軟件對檢測的結(jié)果做一個基因型的分析, 同時分析結(jié)核分枝桿菌分型與基因間的關系。結(jié)果 這200株臨床分離的株全部被鑒定是結(jié)核的分枝桿菌；VNTR顯示結(jié)核桿菌株在不同的位點中具有多種形式的DNA指紋圖譜。結(jié)論 應用分子檢測法, 相比常規(guī)性方法, 它具有全信息化、可以重復以及操作簡單等優(yōu)點。

結(jié)核患者；Version3.0軟件；基因分析；檢驗；分型

目前, 絕大多數(shù)肺結(jié)核患者就診于各級綜合性的醫(yī)院,怎樣才能夠有效地提高這些醫(yī)院對診治肺結(jié)核發(fā)現(xiàn)水平, 這已經(jīng)成為我國醫(yī)院所面臨的一個非常迫切的事項, 只有提高了醫(yī)院的肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)率,才能夠有效地達到該病早期的治療, 早康復, 減少該病的傳染［1,2］。對此, 本文立足結(jié)核分枝桿菌的檢驗和分型理論, 結(jié)核相關前沿性信息, 來探討結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗和分型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院結(jié)核病防治部門從2010年11月-2012年11月間所接診結(jié)核患者的200株結(jié)核分枝桿菌,透過臨床上對分離株實施有效的分析。

1.2 方法 實驗室應用的試劑。在對結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗和分型時要應用GoldViewTMDNA染料、TaqDNA聚合酶以及dNTP, 準備PCR材料［3］。

實驗室所應用的儀器。這些實驗儀器包括DNA的自動擴增儀、菌體培養(yǎng)箱、生物型的安全柜、恒壓恒流的電泳儀以及凝膠成像的系統(tǒng)［4］。

1.3 統(tǒng)計學方法 在本文中, 筆者所采用的相關數(shù)據(jù)均用(x-±s) 表示, 同時使用SPSS10.0軟件實施統(tǒng)計學處理, 同時為加強可信度, 本文中每組之間的數(shù)據(jù)的比較也使用t來進行檢驗, 文中的實驗數(shù)據(jù)都為平均值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學上意義。

2 結(jié)果

2.1 在對這200株結(jié)核分枝桿菌實施監(jiān)測的結(jié)果。運用TCH與PNB對這些200株進行實驗, 同時通過在菌體培養(yǎng)基中出現(xiàn)的問題對這些非結(jié)核性的分枝桿菌、結(jié)核的分枝桿菌進行詳細的分析, 獲得最終結(jié)果為：這200株臨床分離株全部被鑒定為結(jié)核的分枝桿菌。

2.2 在對這200株結(jié)核分枝桿菌進行VNTR的結(jié)果。在本院權威專家實施研究后, 作者進一步選擇了10個基因點進行研究, 對這些結(jié)核桿菌實施相關性的檢測, 同時用H37RV作了進一步的數(shù)據(jù)對照。在此實驗中可知在同一位點的擴增片段中的大小是不一樣的的, 結(jié)核桿菌株在不同的位點中具有多種形式的DNA指紋圖譜。

2.3 藥敏性的結(jié)果。在藥敏性的檢測中, 發(fā)現(xiàn)如下結(jié)果：完全敏感的結(jié)核分枝桿菌有160株, 占到總數(shù)的80%；產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核分枝桿菌有40株, 占到總數(shù)的20%。

3 討論

隨著居民的物質(zhì)生活水平得到顯著提高, 各種疾病也開始侵蝕國民的身體, 結(jié)核病已成為一種常見傳染性疾病, 它是一種慢性的呼吸道的傳染病, 也是當前一個非常突出的一個公共衛(wèi)生問題, 現(xiàn)今在我國, 有結(jié)核菌感染者有4億人左右, 活動性肺結(jié)核病人有600萬左右, 結(jié)核已經(jīng)成為當前社會一種嚴重威脅人類身體健康的傳染病。

如今, 生物工程發(fā)展迅速, 帶動了相關醫(yī)療技術的進步,臨床上我們運用可變數(shù)目的串聯(lián)重新分型技術可以有效的對結(jié)核患者的結(jié)核分支桿菌進行檢驗和分型, 相比常規(guī)性方法,它具有全信息化、可以重復以及操作簡單等優(yōu)點。由于可以運用計算機進行分析, 可以大量的輸入樣本數(shù)據(jù)信息, 這樣得到的數(shù)據(jù)比較可靠。

臨床上, 除了應用分子技術進行檢驗外, 還有涂片法、分離培養(yǎng)法、快速結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗等。

涂片法。涂片法一般讓涂抹的面積保持均勻的涂膜厚度,應用萋尼的染色抗酸進行染色,同時要求每一個涂片最小檢測200個油鏡視野。金胺石炭酸的染色法中的熒光染色最少要有檢測的20個視野, 這種檢測方法相比前一種方法的陽性的檢出率高, 但在特異性上沒有抗酸染色法優(yōu)。

分離培養(yǎng)法。結(jié)核桿菌在培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式常用的有幾種：一是利用雞蛋作為原料的培養(yǎng)基, 一般是運用羅氏的培養(yǎng)基。二是運用瓊脂作為原料的培養(yǎng)基。三是選擇性的培養(yǎng)基, 它可以與一些非選擇性的培養(yǎng)基一起應用, 選擇性的培養(yǎng)基的L-JGrugt 含有奈丁酸、青霉素, 同時培養(yǎng)基中包括林可霉素、放線酮及綦啶酸。四是液體培養(yǎng)基。

快速結(jié)核的分枝桿菌藥敏性試驗。操作方法一般在選用的結(jié)核桿菌的培養(yǎng)基中加進一些利福平藥物、熒光指示劑以及異煙肼藥物。培養(yǎng)基中的熒光一般在有氧的情形下會淬滅,一旦細菌存活下來實施代謝活動, 就會消耗培養(yǎng)基中的氧氣,熒光又會復發(fā)。應用365的紫外線燈下有沒有熒光來判斷耐藥或者敏感。這是由于熒蟲酶的基因進入培養(yǎng)基中的結(jié)核桿菌的嗜菌體, 嗜菌體在侵染存活的結(jié)核桿菌就會發(fā)出熒光。這些菌體在于一定濃度的藥物相互作用后, 如果這些菌體存活下來就會侵染嗜菌體, 觀測到有熒光的就是耐藥, 沒有熒光的就是敏感菌。

在一般分型中, 用RFLP技術實施結(jié)核菌的分型。臨床上,運用結(jié)核的分支桿菌插進序列IS6100的片段作為探針, 這樣就能夠運用結(jié)核桿菌DNA實施鑒定、分型, IS6100的片段一般僅存在結(jié)核分支桿菌中的復合基因組, 利用PVU-Ⅱ進行切割, 并用245BP的探針實施雜交, 這樣就能夠出現(xiàn)9～24條帶,能夠用在流行病學的分析, 例如在菌株, 結(jié)核分枝桿菌的標準菌株是H37RV和減毒性的結(jié)核分枝桿菌是H37RA。測定菌株經(jīng)改良鑼氏培養(yǎng)基培養(yǎng), 并鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

對于結(jié)核病的管理工作也是一項非常重大環(huán)節(jié), 在以上的預防措施的基礎上, 建立有效完善的可疑的肺結(jié)核者相關處理指引和報告制度。醫(yī)護人員一旦發(fā)現(xiàn)可疑的肺結(jié)核者后,就需要進行正確有效地進行現(xiàn)場隔離可疑的肺結(jié)核者的這些緊急的操作措施, 在依據(jù)可疑的肺結(jié)核者的具體情況決定采取何種藥物、治療干預措施。在此基礎上, 做好相關報告、登記程序, 并對肺結(jié)核患者身體狀況進行追蹤工作。

［1］ 蔣毅,張麗水,趙秀芹, 等. MLVA技術用于福建105株結(jié)核分枝桿菌基因分型的初步研究.中國人獸共患病學報.2007,17(03)：173-175.

［2］ 吳長東,米利古,龔天美, 等. RD105缺失基因檢測法用于結(jié)核分枝桿菌新疆“北京家族”臨床分離株的鑒定.中國病原生物學雜志.2010,15(03):183-184.

［3］ Borna Muller,Lin-Mari de Klerk-Lorist,Marijke M.Henton,et al.Mixed infections of Corynebacterium pseudotuberculosis and non-tuberculous mycobacteria in South African antelopes presenting with tuberculosis-like lesions.Veterinary Microbiology .2011,15(06)：73-75.

［4］ D.J.Stewart,J.A.Vaughan,P.L.Stiles,et al.A long-term bacteriological and immunological study in Holstein-Friesian cattle experimentally infected with Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis and necropsy culture results for Holstein-Friesian cattle, Merino sheep and Angora goats.Veterinary Microbiology .2007,18(02):283-284.

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