陳迪釗，朱士龍，李 勇，林紅衛(wèi)，段友構(gòu)

(1.懷化學(xué)院化學(xué)化工系，湖南 懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008；3.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

青藤堿(sinomenine，SN)是從青風(fēng)藤(Caulis sinomenii)中提取的一種有效成分，具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、抗心律失常等多種生物活性[1-4]。青藤堿在水溶液中溶解度較低，且對(duì)堿、光、熱不穩(wěn)定，易分解，故在醫(yī)藥、食品及保健品工業(yè)上常用其鹽酸鹽[5-6]。由于人體皮膚、口腔、胃黏膜等對(duì)酸、堿度較敏感，現(xiàn)有青藤堿的成品和制劑因其酸性過(guò)大，對(duì)人體產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激作用，導(dǎo)致其在醫(yī)藥、保健品等使用中受到一定的限制。

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)是淀粉降解的環(huán)狀低聚化合物，具有特殊的空腔結(jié)構(gòu)[7]。CD可以和不同系列的客體分子發(fā)生包合作用，提高客體分子的溶解性和穩(wěn)定性[8-9]。CD的這種獨(dú)特的性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥工業(yè)中[10-12]。從目前CD的研究情況看，β-CD的應(yīng)用最為常見(jiàn)[13-14]，但由于β-CD本身的水溶性小、組織刺激性大等缺點(diǎn)限制了其更廣泛的應(yīng)用，γ-CD的空腔直徑和空腔體積要大于β-CD，且具有水溶性好、局部刺激小且毒性最小等優(yōu)點(diǎn)[15]。青藤堿與γ-CD的包合作用研究未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選取γ-CD對(duì)青藤堿分子進(jìn)行包合，成功制備γ-CD與青藤堿的包合物，并通過(guò)X射線粉末衍射(XRD)、紅外光譜(IR)、差示掃描量熱分析(DSC)、核磁共振(HNMR)等技術(shù)對(duì)包合物進(jìn)行表征及基本性質(zhì)研究，對(duì)青藤堿作為藥品和保健品現(xiàn)有制劑的研究和改進(jìn)具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值，為環(huán)糊精在食品、保健品、化妝品等方面的開(kāi)發(fā)和進(jìn)一步研究應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸青藤堿(含量99.12%，批號(hào)100802) 陜西森弗生物技術(shù)有限公司；γ-環(huán)糊精(含量98.50%，批號(hào)100701)上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純；其他化學(xué)試劑均為分析純；用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker D8 X射線粉末衍射儀 德國(guó)布魯克公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)、HPLC-10AT高效液相色譜儀(SPD-10AVP紫外檢測(cè)器)、DSC-60差示掃描量熱分析儀 日本島津公司；Nikon SMZ-1000體式研究顯微鏡 日本尼康株式會(huì)社；MAGNA-IR750型FTIR紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；INOVA-400核磁共振儀 美國(guó)Varian 公司。

1.3 方法

1.3.1 游離青藤堿的制備與純化

由于實(shí)驗(yàn)所需藥品為青藤堿，需對(duì)所購(gòu)鹽酸青藤堿進(jìn)行游離青藤堿的制備。按文獻(xiàn)[16]精確稱(chēng)取鹽酸青藤堿，溶于一定量的二次蒸餾水中，攪拌使之充分溶解后逐滴加入氨水，產(chǎn)生乳白色膠狀沉淀，繼續(xù)加氨水至不再有新的沉淀產(chǎn)生為止。然后用氯仿萃取，將氯仿層用新蒸蒸餾水反復(fù)萃洗至中性。氯仿層用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得白色青藤堿粉末，放入干燥器中備用。

1.3.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

取青藤堿、γ-CD，加蒸餾水溶解，以蒸餾水作為對(duì)照，分別在紫外分光光度計(jì)200～500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，γ-CD在此范圍內(nèi)無(wú)吸收，青藤堿在265nm波長(zhǎng)處有較大吸收，所以選擇波長(zhǎng)265nm為青藤堿測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.3γ-CD對(duì)青藤堿的增溶作用研究

分別配制濃度為0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，將純化后的青藤堿加入使之達(dá)到飽和，溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，稀釋相同倍數(shù)后利用紫外吸收光譜在265nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。通過(guò)測(cè)定青藤堿的含量考察γ-CD濃度對(duì)青藤堿溶解度的影響。

1.3.4 青藤堿-γ-CD包合物的制備

環(huán)糊精與客體分子形成包合物的制備方法有共沉淀法、逐步滴加法、固體混合法等多種[17-19]，通過(guò)溶液法制備環(huán)糊精與客體分子包合物是實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中最常用的制備路線。因此本實(shí)驗(yàn)利用溶液共混法制備青藤堿-γ-CD包合物，制備工藝如下[20]：25℃條件下，按青藤堿與γ-CD物質(zhì)的量比1∶1取樣，在不斷攪拌的條件下將青藤堿緩緩加入到γ-CD的飽和水溶液中，50℃條件下攪拌3h以確保包合反應(yīng)進(jìn)行完全。冷卻至室溫后置于冰箱中4℃條件下放置48h，由于γ-CD在水中溶解度較大，置于冰箱中4℃左右放置48h后未見(jiàn)晶體析出；置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器下，50℃旋蒸出部分水，溶液出現(xiàn)渾濁，抽濾得少量包合物固體，小心將包合物用少量石油醚洗滌，室溫干燥，置于干燥器中，備用。

1.3.5 青藤堿-γ-CD包合物的吉布斯自由能變化

分別配制濃度為0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，加青藤堿使之達(dá)到飽和，溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，稀釋相同倍數(shù)后利用紫外吸收光譜在265nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制青藤堿在γ-CD溶液中的溶解度曲線，并計(jì)算包合反應(yīng)前后的吉布斯自由能變化。

1.3.6 青藤堿-γ-CD包合物的性質(zhì)研究

將制備的青藤堿-γ-CD包合物分別通過(guò)顯微晶體、X射線粉末衍射、差示掃描量熱分析、紅外光譜及核磁共振等方式進(jìn)行表征和性質(zhì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-CD對(duì)青藤堿的增溶作用研究

圖1 γ-CD 對(duì)青藤堿增溶作用的光譜圖Fig.1 UV spectrum of SN-γ-CD inclusion complex

由圖1可知，隨著γ-CD濃度的增加，青藤堿的溶解度逐漸增大，γ-CD對(duì)青藤堿有明顯的增溶作用。

2.2 青藤堿-γ-CD包合物的相溶解度及吉布斯自由能變化研究

青藤堿的溶解度隨環(huán)糊精的加入呈線性增加，根據(jù)Benesi-Hildebrand公式，該體系相溶解度曲線方程為典型的AL型，確定青藤堿與γ-CD的包合計(jì)量比為1∶1，則相溶解度方程為式(1)。

式中：c(CD)為環(huán)糊精物質(zhì)的量的總濃度/(mol/L)；c0為CD存在下客體青藤堿分子的總濃度/(mol/L)；S0為客體青藤堿分子的固有溶解度(曲線的截距)；K為包合物的形成常數(shù)/(L/mol)。

以客體濃度對(duì)CD濃度作圖，如圖2所示，由圖中的斜率和截距可獲得包合物的形成常數(shù)K，根據(jù)包合常數(shù)K計(jì)算包合前后的吉布斯自由能變化，見(jiàn)式(2)、(3)[21]。

圖2 青藤堿在25℃γ-CD溶液中的相溶解度圖Fig.2 Effect of γ-cyclodextrin on the solubility of sinomenine in water at 25 ℃

經(jīng)計(jì)算得：青藤堿與γ-CD的包合常數(shù)為600.3L/mol，該反應(yīng)的吉布斯自由能為ΔG=－15.85kJ/mol。

2.3 青藤堿-γ-CD包合物的性質(zhì)

2.3.1 青藤堿與γ-CD包合物的顯微晶體分析

圖3 青藤堿、γ-CD及包合物的顯微晶體圖片F(xiàn)ig.3 Crystal properties of SN-γ-CD inclusion complex

將制備的青藤堿、γ-CD及包合物經(jīng)純化后置于Nikon SMZ-1000體式研究顯微鏡下觀察，如圖3所示。青藤堿、γ-CD、青藤堿-γ-CD包合物存在較大區(qū)別；其中鹽酸青藤堿是針狀結(jié)晶，青藤堿是棱柱狀結(jié)晶，γ-CD沒(méi)有固定形態(tài)應(yīng)為無(wú)定形結(jié)晶，青藤堿-γ-CD包合物的晶體形態(tài)不同于青藤堿也不同于γ-CD；青藤堿、γ-CD及青藤堿-γ-CD包合物顆粒的直徑大小不相同。由晶體特征可以初步推測(cè)：青藤堿與γ-CD形成的包合物應(yīng)是新的晶體形態(tài)。

2.3.2 青藤堿與γ-CD包合物的X射線衍射分析

對(duì)青藤堿、γ-CD及包合物進(jìn)行XRD分析，分析條件：室溫，Cu靶(Kα射線，波長(zhǎng)=1.54187?)掃描電壓40kV，管電流40mA，掃描速率2°/min，采樣間隔為0.02°，掃描范圍5°～80°。30°以后圖譜無(wú)明顯變化，取5°～30°所得XRD圖譜如圖4所示。γ-CD的XRD峰形呈現(xiàn)出彌散形態(tài)，但其圖譜上明顯出現(xiàn)隆起并有少許強(qiáng)度較低的特征衍射峰出現(xiàn)，說(shuō)明γ-CD的晶形介于微晶與晶體形態(tài)之間；在青藤堿-γ-CD的包合物圖譜上可以看出，青藤堿-γ-CD包合物的晶形與γ-CD類(lèi)似，沒(méi)有良好的結(jié)晶形態(tài)；青藤堿-γ-CD包合物中出現(xiàn)一組明顯新的特征衍射峰(2θ= 7.42°、2θ= 14.52°、2θ= 20.34°)，此外青藤堿、γ-CD的特征衍射峰在其包合物中幾乎完全消失；青藤堿-γ-CD包合物表現(xiàn)出明顯不同于前兩者的新的特征性質(zhì)，說(shuō)明青藤堿-γ-CD包合物是一種新的物質(zhì)形態(tài)。

圖4 青藤堿(a)、青藤堿-γ-CD包合物(b)與γ-CD (c) XRD比較Fig.4 X-ray diffraction of sinomenine (a), SN-γ-CD inclusion complex(b) and γ-CD (c)

2.3.3 青藤堿-γ-CD包合物的差示掃描量熱分析

圖5 青藤堿(a)、γ-CD(b)、青藤堿與γ-CD物理混合物(c)、青藤堿-γ-CD包合物(d)DSC圖Fig.5 DSC diagrams of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture (c) and inclusion complex (d)

測(cè)試條件：坩堝：鋁坩堝；參比物：Al2O3；氣氛：N2；升溫速率為10℃/min；升溫范圍為30～350℃，結(jié)果見(jiàn)圖5。青藤堿在160.6℃及182℃出現(xiàn)2個(gè)尖銳的特征吸熱峰；298℃的吸熱峰表明γ-CD的熔點(diǎn)在298℃左右，83℃出現(xiàn)的吸熱峰說(shuō)明γ-CD含有少量水存在。在兩者的物理混合物的DSC圖譜中，青藤堿的吸熱峰強(qiáng)度顯著降低，但峰的位置沒(méi)有發(fā)生明顯變化；而在兩者的包合物的DSC圖譜中，青藤堿的吸收峰完全消失，且γ-CD的吸熱峰也沒(méi)有出現(xiàn)，較青藤堿和γ-CD的圖譜有明顯的差異。

2.3.4 青藤堿-γ-CD包合物的紅外光譜分析

采用KBr壓片法測(cè)定青藤堿、γ-CD、物理混合物和包合物的紅外光譜，分辨率為2cm-1，4000～400cm-1全譜掃描，所得紅外圖譜見(jiàn)圖6。3600cm-1左右出現(xiàn)的是青藤堿酚羥基的吸收峰，在3000cm-1以下有芳環(huán)骨架上的C—H伸縮振動(dòng)，1688cm-1左右出現(xiàn)了較強(qiáng)的羰基吸收峰，1635、1510cm-1處出現(xiàn)芳環(huán)骨架振動(dòng)，N—CH3及O—CH3表現(xiàn)為1450cm-1左右的彎曲振動(dòng)。γ-CD主要紅外特征吸收峰有：3384cm-1為γ-CD上多締合體—OH的伸縮振動(dòng)；2924cm-1甲基、亞甲基C—H的伸縮振動(dòng)；1647cm-1，結(jié)合水振動(dòng)；1417、1259cm-1—OH的平面彎曲振動(dòng)；1367、1336、1303cm-1C—H彎曲振動(dòng)；1156cm-1C—O—C的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)；1080、1030cm-1，C—C、C—O或C—C—O的伸縮振動(dòng)。青藤堿與γ-CD的物理混合紅外光譜圖中，青藤堿的吸收峰均明顯存在，只是疊加了γ-CD的吸收峰。青藤堿與γ-CD包合物的紅外譜圖中，青藤堿的一些特征吸收峰強(qiáng)度明顯降低，峰形變寬，其中芳環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰產(chǎn)生了較大的位移(1587～1509cm-1)或者消失(1122cm-1)，單鍵伸縮振動(dòng)及彎曲振動(dòng)的指紋區(qū)(1300～1000cm-1)的許多吸收峰也出現(xiàn)消失或較大位移，如1284、1198、1145、1056cm-1等。

圖6 青藤堿(a)、γ-CD(b)、青藤堿與γ-CD物理混合物(c)及青藤堿-γ-CD包合物(d)紅外光譜圖Fig.6 IR spectra of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture(c) and inclusion complex (d)

以上紅外特征光譜的變化充分說(shuō)明：γ-CD與青藤堿主客體分子間發(fā)生了相互作用，青藤堿分子進(jìn)入γ-CD的空腔中，包合物已經(jīng)形成。

2.3.5 青藤堿-γ-CD包合物的核磁共振分析

表1 包合物形成前后γ-CD的氫核化學(xué)位移變化Table 1 Change in 1H chemical shift of γ-CD before and after inclusion with sinomenine

對(duì)青藤堿、γ-CD及其包合物進(jìn)行1HNMR分析，分析條件：DMSO-d6、400MHz、25℃，通過(guò)不同圖譜的分析比較，氫質(zhì)子位移變化如表1所示?？腕w青藤堿分子和主體γ-CD分子包合后，γ-CD的質(zhì)子發(fā)生明顯的化學(xué)位移，青藤堿的質(zhì)子H在包合物的圖譜上峰高和峰面積發(fā)生很大變化。γ-CD的質(zhì)子H3和H5及2—OH、3—OH、6—OH發(fā)生明顯偏移，而H2和H4的變化很小，造成這一現(xiàn)象的主要原因與青藤堿及γ-CD的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。分析其可能原因是包合物形成后，青藤堿分子進(jìn)入γ-CD空腔內(nèi)部，由于客體分子芳香基團(tuán)環(huán)電流的影響位于γ-CD空腔內(nèi)壁的兩個(gè)質(zhì)子H3和H5發(fā)生移動(dòng)，化學(xué)位移值發(fā)生變化。青藤堿分子上的基團(tuán)與環(huán)糊精分子的2—OH、3—OH、6—OH形成分子間氫鍵，電子屏蔽作用減小[22]，吸收峰將移向低場(chǎng)，化學(xué)位移值增大。通過(guò)青藤堿氫質(zhì)子峰面積的減小及氫質(zhì)子的位移變化充分說(shuō)明青藤堿分子與γ-CD之間發(fā)生了作用，青藤堿分子已經(jīng)進(jìn)入到γ-CD空腔中。

3 結(jié) 論

通過(guò)溶液共混法成功制備了青藤堿與γ-CD的包合物，并通過(guò)晶體形態(tài)的顯微圖像、差示掃描量熱分析、紅外光譜、X射線粉末衍射及核磁共振等方式對(duì)包合物進(jìn)行了基本性質(zhì)的研究和分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明γ-CD對(duì)青藤堿具有明顯的增溶作用，青藤堿-γ-環(huán)糊精包合物表現(xiàn)出明顯不同于青藤堿的特征波譜性質(zhì)。利用相溶解度法計(jì)算出青藤堿與γ-CD形成的包合物的包合物質(zhì)的量比均為1∶1，其包合常數(shù)為600.3L/mol，該反應(yīng)的吉布斯自由能變化為ΔG=－15.85kJ/mol。實(shí)驗(yàn)結(jié)論為青藤堿作為藥品和保健品的開(kāi)發(fā)和現(xiàn)有制劑方式的改進(jìn)提供重要的參考，為環(huán)糊精在食品、保健品及化妝品等工業(yè)的進(jìn)一步研究應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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