陳芝蘭，楊吉霞，李夢(mèng)寒，李曉衛(wèi)，南志強(qiáng)，鞏文峰

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

西藏自治區(qū)是全國(guó)五大牧區(qū)之一，生活在該區(qū)域的藏民族多以飼養(yǎng)牦牛為生，該地區(qū)牦牛的數(shù)量約占全國(guó)總量的30%[1]。相對(duì)牛乳而言，牦牛乳含有較高的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，被稱為“天然濃縮乳”，是高原地區(qū)重要食品和乳品加工原料[2]。藏民族素有食用酸奶的傳統(tǒng)習(xí)慣，千百年來(lái)沿襲古老而傳統(tǒng)的方法制作酸奶。一般采用存放發(fā)酵奶和鮮奶的相同容器來(lái)進(jìn)行持續(xù)發(fā)酵[3]，這也導(dǎo)致了當(dāng)?shù)氐陌l(fā)酵產(chǎn)品逐漸演變，使產(chǎn)品不僅風(fēng)味獨(dú)特、組織細(xì)膩、口感純正，同時(shí)還保存了自然環(huán)境中的乳酸菌資源。西藏地區(qū)海拔高，氣溫低，晝夜溫差大，紫外線輻射強(qiáng)，生態(tài)環(huán)境特殊，不同牧民家庭制備傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品所采用的原料、工藝等方面的差異，以及不同地域的自然環(huán)境和氣候，造就了乳酸菌資源豐富的生物多樣性。對(duì)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離、鑒定和生物學(xué)特性研究，有利于推動(dòng)對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)乳制品乳酸菌種類認(rèn)識(shí)及其優(yōu)良菌株在特色乳制品中的應(yīng)用，具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)從西藏地區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳進(jìn)行乳酸菌的分離、鑒定，旨在發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)所含乳酸菌類群，以期利用豐富我國(guó)的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

樣品采自西藏自治區(qū)7個(gè)地區(qū)56戶牧民家庭。將牧民自然發(fā)酵制作的酸奶，在其發(fā)酵容器中充分?jǐn)嚢韬?，吸?0mL裝入無(wú)菌容器中，均放入冰盒內(nèi)，備用。在采樣現(xiàn)場(chǎng)用便攜式pH計(jì)測(cè)定酸奶的pH值。樣品采集地、樣品的代號(hào)和樣品數(shù)見表1。

表1 西藏發(fā)酵牛乳采集地點(diǎn)及數(shù)量Table 1 Fermented milk samples tested in this study

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus acidophilusATCC 4356T為CICC保藏菌種，其編號(hào)為CICC6075T。

1.1.3 試劑

培養(yǎng)基及生理生化實(shí)驗(yàn)用試劑參照文獻(xiàn)[4-6]中的方法配制；緩沖液與常備試劑參照文獻(xiàn)[7]制備。Taq酶、dNTP、DNA Marker 天為時(shí)代生物有限公司；GoldView 北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS) 北京華綠淵生物技術(shù)發(fā)展公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌數(shù)量分析

將發(fā)酵乳樣品用滅菌生理鹽水做10倍遞增稀釋，各取3個(gè)稀釋度，設(shè)3個(gè)重復(fù)。用MRS(加0.02g/100mL放線菌酮和多黏菌素)、PDA(加0.03g/100mL鏈霉素)培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)，于37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h，進(jìn)行染色、鏡檢、計(jì)數(shù)。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化

將發(fā)酵乳樣品劃線接種于含有10μg/g放線菌酮的MRS(加入0.5g/100mL碳酸鈣)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h。記錄菌落形態(tài)，挑取有透明環(huán)的菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線分離，至確定為純菌。將純化后的菌株進(jìn)行斜面保存、甘油法低溫凍存。

1.2.3 乳酸菌的生理生化鑒定

按照文獻(xiàn)[5,8-11]介紹的方法，凡是革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性的菌株初步確定為乳酸菌，然后按表2的鑒定程序及項(xiàng)目區(qū)分不同的乳酸菌菌屬，并通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特征、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等對(duì)種進(jìn)行鑒定。

表2 乳酸菌鑒定程序及實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目Table 2 Identification procedure and indicators of lactic acid bacteria

1.2.4 16S rRNA基因序列同源性分析

將分離的乳酸菌菌株，提取基因組DNA[7,12]，采用正向引物27f：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，反向引物1541r：5’-AAG GAG GTG ATC CACCC-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]，PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http://wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，與待測(cè)菌株同源性最高的已知分類地位的菌種初步確定待測(cè)菌株的種屬。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已知的乳酸菌菌株的16S rRNA序列，以Clustal X[14]進(jìn)行序列比對(duì)后，用MEGA4.0的UPGMA(unweighted pair-groupmethod with arithmetic means)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)。利用16S rRNA基因序列同源性分析的方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的分布

采用稀釋傾注選擇分離法在各樣品中均分離到乳酸菌和酵母菌，西藏7個(gè)地區(qū)56戶牧民家庭傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中微生物數(shù)量和種類如表3所示。乳酸菌數(shù)量變化幅度為1.01～8.58(lg(CFU/mL))，乳酸菌平均含量為(6.38±1.54)(lg(CFU/mL))，各地區(qū)乳酸菌平均含量以山南、那曲＞昌都、日喀則＞林芝＞拉薩＞阿里，各個(gè)地區(qū)間乳酸菌平均含量差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)，同一地區(qū)不同牧民家庭制作發(fā)酵乳乳酸菌含量差異以那曲最小，拉薩最大。而酵母菌數(shù)量變化幅度為2.09～7.16(lg(CFU/mL))，酵母菌平均含量為(5.27±1.63)(lg(CFU/mL))，各地區(qū)酵母菌平均含量以阿里地區(qū)顯著性(P＜0.05)高于其他地區(qū)，同一地區(qū)不同牧民家庭制作發(fā)酵乳酵母菌含量差異以阿里最小，昌都最大。采自阿里的兩份發(fā)酵乳酵母菌總數(shù)比乳酸菌總數(shù)大6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，其他54份樣品中的乳酸菌總數(shù)比酵母菌的總數(shù)多，56份酸牛奶樣品中乳酸菌平均含量((6.38±1.54)(lg(CFU/mL)))比酵母菌平均含量((5.27±1.63)(lg(CFU/mL)))大1個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。結(jié)果表明西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛乳中富含乳酸菌和酵母菌，以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌群，微生物數(shù)量的差異可能和當(dāng)?shù)氐牡乩砦恢谩夂蚣爸谱鳁l件如接種量、接種時(shí)間、發(fā)酵溫度等因素有關(guān)。

表3 西藏發(fā)酵牛乳微生物組成分析Table 3 Microbial composition analysis of fermented milk samples collected in Tibet

2.2 乳酸菌生理生化鑒定結(jié)果

將分離的96株桿菌進(jìn)行屬的鑒定，結(jié)果表明：均為革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，在H2O2酶實(shí)驗(yàn)、硝酸還原實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)(與丹毒絲菌屬相區(qū)分)呈陰性，在pH 4.5的環(huán)境中生長(zhǎng)(與肉食桿菌屬相區(qū)分)的桿菌，符合乳桿菌屬的生物學(xué)特性，被鑒定為乳桿菌屬的細(xì)菌。進(jìn)一步以L.acidophilusATCC4356T(CICC保藏菌種，編號(hào)為CICC6075)為參考菌株，按照種特性實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了種的鑒定[5,10]。結(jié)果(表4)表明：48個(gè)菌株(群1)大部分性狀一致，與L.casei的特性相近，18個(gè)菌株(群2)大部分性狀一致，與L.plantarum的特性相近，7個(gè)菌株(群3)大部分性狀一致，與L.fermentum的特性相近，4個(gè)菌株(群4)大部分性狀一致，與L.breris的特性相近，9個(gè)菌株(群5)大部分性狀一致，與L.parabuchneri的特性相近，5個(gè)菌株(群6)大部分性狀一致，與L.delbrueckiisubsp.bulgaricus的特性相近，2個(gè)菌株(群7)大部分性狀一致，與L.acidophilu的特性相近，3個(gè)菌株(群8)大部分性狀一致，將糖發(fā)酵等生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果查找文獻(xiàn)[5,10]無(wú)對(duì)應(yīng)菌種。

表4 分離自西藏發(fā)酵乳中的乳酸菌的生理特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria isolated from Tibetan fermented milk products

由表4可知，于MRS平板劃線厭氧分離的14株球菌革蘭氏染色陽(yáng)性、H2O2酶陰性、不運(yùn)動(dòng)、硝酸鹽實(shí)驗(yàn)陰性，符合乳酸球菌的特性。2個(gè)菌株葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣似明串珠菌屬(Leuconostoc)。1個(gè)菌株在35℃和45℃均生長(zhǎng)，在pH9.6不生長(zhǎng)，在4.0g/100mL NaCl、6.5g/100mL NaCl生長(zhǎng)，18g/100mL NaCl不生長(zhǎng)符合片球菌屬(Pediococcus)的特征。2個(gè)菌株在10℃生長(zhǎng)、45℃不生長(zhǎng)，6.5g/100mL NaCl不生長(zhǎng)，似乳球菌屬(Lactococcus)。1個(gè)菌株10℃和45℃、6.5g/100mL NaCl、pH9.6菌生長(zhǎng)，葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)陰性，似腸球菌屬(Enterococcus)。

2.3 16S rRNA基因序列分析

選取Lactobacillus、Leuconostoc等的代表菌株和沒有經(jīng)生理生化鑒定到菌種的共33個(gè)菌株，提取其基因組DNA，擴(kuò)增其16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序，將16S rRNA基因序列在GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，各受試菌株與相關(guān)菌種的同源性都在99%以上。為顯示供試菌株與已知菌種之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，由待測(cè)33株乳酸菌的16S rRNA序列與12株參考菌株的16S rRNA序列用MEGA4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1，系統(tǒng)發(fā)育樹以兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)16S rRNA基因序列作為外群，序列一致長(zhǎng)度為1400bp。45個(gè)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示10個(gè)分支：LZ3-1、LS11-1、RKZ1-3、SN11-1、RKZ3-1、NQ7-1、RKZ4-1、LS9-3、LS5-1、LS2-1、LS3-1、LS12-2、SN5-1、LS8-2、SN8-1和L.caseiATCC334 D86517處于一個(gè)分支；LS14-2、LS6-1、LS7-1、LS7-2、LS6-2和Lactobacillus paracaseiATCC25302 HQ23165、Lactobacillus caseiATCC339 AF469172處于一個(gè)分支；LS2-3和Lactobacillus fermentumCIP102980 JN175331處于一個(gè)分支；LS14-1、RKZ12-1、RKZ12-2和Lactobacillus diolivoransYIT10368 AB429369處于一個(gè)分支；NQ3-1和Lactobacillus parabuchneriDSM5707 AB370877處于一個(gè)分支；LS2-2和Lactobacillus brerisNRIC0137 AB362618處于一個(gè)分支；SN6-2、CD2-2、LS15-1和Lactobacillus plantarumNBRC15891 AB626055處于一個(gè)分支；LS4-1和Lactobacillus delbrueckiiBCRC10696 AY773948處于一個(gè)分支；LS3-4和Pediococcus acidilacticiNBRC12218 AB680261處于一個(gè)分支；NQ4-1、LS12-1和Leuconostoc mesenteroidesNRIC1541 AB023243處于一個(gè)分支。

圖1 分離乳酸菌菌株和相關(guān)菌株16S rRNA 基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of tested lactic acid bacteria and relevant strains

2.4 分離菌株的綜合鑒定結(jié)果

48株生理生化鑒定為L(zhǎng).casei的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列分析結(jié)果為L(zhǎng).casei和L.paracasei，再次證實(shí)干酪乳桿菌群內(nèi)的16S rRNA基因序列相似性達(dá)到99%以上，種水平分辨率比較低，采用表型特征鑒定和區(qū)分的準(zhǔn)確性也會(huì)降低[16]；19株L.plantarum中，除1株菌可在45℃條件下生長(zhǎng)外，其余18株生理生化鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)[5,10]完全相符；分離自日喀則南木林縣RKZ12-1與RKZ12-2 和分離墨竹工卡扎雪鄉(xiāng)LS14-1的3株菌，糖醇發(fā)酵無(wú)相似種，16S rRNA基因測(cè)序鑒定與L.diolivoransYIT10368基因相似性高達(dá)99%；其他菌株生理生化鑒定結(jié)果與16S rRNA基因測(cè)序鑒定結(jié)果完全吻合。

根據(jù)表2和表4將乳酸球菌鑒定到4個(gè)屬，1株生理生化鑒定為片球菌屬的菌株與Pediococcus acidilacticiNBRC12218的基因相似性高達(dá)99%；明串珠菌屬內(nèi)10個(gè)菌株碳水化合物發(fā)酵特征十分相似，單純依據(jù)生理生化指標(biāo)，很難鑒定到種，16S rRNA基因測(cè)序鑒定結(jié)果，NQ4-14、LS12-1與Ln.mesenteroidesNRIC1541的基因相似性高達(dá)99%。總體來(lái)說(shuō)，生理生化結(jié)果與16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果能較好地相吻合。

2.5 發(fā)酵乳中乳酸菌種類及分布

表5 西藏地區(qū)乳酸菌屬型及乳桿菌分布Table 5 Classification and distribution of the genus and species in fermented milk products from different pasturing areas of Tibet

由表5可知，從西藏7個(gè)地區(qū)56份發(fā)酵乳中均分離到乳酸菌。共分離乳酸菌110株，經(jīng)鑒定分別歸為乳桿菌屬(96株)、明串珠菌屬(10株)、乳球菌屬(2株)、腸球菌屬(1株)、片球菌屬(1株)5個(gè)屬。其中，歸于乳桿菌屬的有8個(gè)種，L.casei(占分離株的43.64%)為優(yōu)勢(shì)種，分布于整個(gè)西藏地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，其次為L(zhǎng).plantarum，再次為L(zhǎng).parabuchneri；菌株多樣性豐富度以RKZ、LS＞SN＞NQ＞CD＞LZ＞AL；基物樣品分離比在1～2.75間，以CD最高，AL最低；分離到的乳酸桿菌和乳酸球菌的比例相差較大，乳酸桿菌占87.27%，為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌群。

3 結(jié) 論

3.1 本研究從西藏地區(qū)自然發(fā)酵的56份酸奶樣品中，共分離出110株乳酸菌。其中，乳酸桿菌96株占分離株的87.27%，為優(yōu)勢(shì)菌群，分別是L.casei48株、L.plantarum18株、L.parabuchneri9株、L.fermentum7株、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus5株、L.breris4株、L.acidophilus2株、L.diolivorans3株，L.casei占分離株的43.64%，是優(yōu)勢(shì)菌群；10株乳酸球菌為明串珠菌屬(Leuconostoc)10株、乳球菌屬(Lactococcus)2株、腸球菌屬(Enterococcus)1株、片球菌屬(Pediococcus)1株；56份發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)平均含量為(6.38±1.54)(lg(CFU/mL))，酵母菌平均含量為(5.27±1.63)(lg(CFU/mL))，乳酸菌比酵母菌高一個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，為主要發(fā)酵菌群。

3.2 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品常常是混合菌株發(fā)酵，不同區(qū)域發(fā)酵乳中乳酸菌的種類有差異，但菌株與區(qū)域之間無(wú)必然聯(lián)系，L.casei分布于整個(gè)西藏地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，其次為L(zhǎng).plantarum，再次為L(zhǎng).parabuchneri，日喀則和拉薩地區(qū)菌株豐富度較好。分菌時(shí)根據(jù)菌落、菌體形態(tài)從同一樣品中分出許多不同的菌株，但序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)這些“不同”的菌都?xì)w于同種菌，同種菌株間形態(tài)和生理生化特性略有差異。

3.3 從西藏牧民家庭自制的發(fā)酵乳中分離到的乳桿菌大多是15、37℃生長(zhǎng)、45℃弱生長(zhǎng)的中溫菌株。其原因與牧區(qū)牧民家庭制作的發(fā)酵乳，往往存放在非恒溫狀態(tài)的環(huán)境中，菌株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期適應(yīng)西藏相對(duì)低溫氣候環(huán)境，形成了這種在廣泛溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)的特性，說(shuō)明被分離菌株的適應(yīng)能力增強(qiáng)。

3.4 分離鑒定的110株乳酸菌，涉及到乳品中常見也是發(fā)酵工業(yè)上常用的乳酸菌。乳桿菌屬中鑒定出8種乳桿菌分別為3種發(fā)酵類群，且都能發(fā)酵乳糖。分離的乳桿菌普遍具有發(fā)酵果糖、棉子糖、蜜二糖的能力，這些差異可能與環(huán)境條件有關(guān)。分離鑒定的乳球菌菌株無(wú)論是種類還是數(shù)量都很少，這可能與酸奶較低的pH值(pH值為3.70±0.24)有關(guān)[17]，致使乳球菌生長(zhǎng)受到抑制，活性也不高。14株球菌中，明串珠菌(10株)占優(yōu)勢(shì)，可能正是它們賦予了酸奶優(yōu)良的風(fēng)味和質(zhì)地。

3.5 采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在MRS培養(yǎng)基于37℃厭養(yǎng)培養(yǎng)分析傳統(tǒng)乳制品中微生物的多樣性，但某些乳酸菌由于其活力不夠、適應(yīng)相對(duì)低溫氣候環(huán)境或不可在分離培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能被有效地分離，造成對(duì)環(huán)境微生物多樣性的低估[18]，須采用更多培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)的方法相結(jié)合考察乳制品中微生物的多樣性。

3.6 實(shí)驗(yàn)中傳統(tǒng)與分子生物學(xué)分類結(jié)果相符。但傳統(tǒng)的生理生化方法鑒定乳酸菌耗時(shí)長(zhǎng)，而且，其鑒定結(jié)果也有不確定性[19]，采用16S rRNA序列分析對(duì)發(fā)酵酸乳中乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，比傳統(tǒng)的生化實(shí)驗(yàn)鑒定準(zhǔn)確度高、結(jié)果更可靠，因此，認(rèn)為只有將分子生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合起來(lái)才能更加準(zhǔn)確的鑒定出乳酸菌。

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