俞 星，鄭春姬，韓春姬,,*，姜國哲，崔成弼

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研部，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133002)

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一種很強的化學(xué)致癌物，通常用于原發(fā)性肝癌動物模型的制作，可用于研究肝癌的發(fā)病機理及其防治。DEN誘發(fā)小鼠肝癌模型，其特點為誘癌成功率高，肝癌細(xì)胞所占比例大[1]，且其誘發(fā)的腫瘤多為肝細(xì)胞癌，與人肝細(xì)胞癌相似[2-3]。DEN誘發(fā)大鼠肝癌的過程要經(jīng)過3個階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)[4]。

輪葉黨參(Codonopsis lanceolata)又名山海藻，屬于桔?？泣h參屬植物，廣泛分布于中國、韓國、朝鮮、日本等地。輪葉黨參主要是作為山野菜食用，未見任何毒副作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，輪葉黨參提取物具有抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤、抗疲勞以及提高機體免疫力等作用[5-8]。本實驗室前期的研究結(jié)果表明，輪葉黨參提取物具有顯著的預(yù)防化學(xué)性肝損傷的作用[9-10]。最近的研究結(jié)果表明，輪葉黨參經(jīng)活性酵母發(fā)酵后，其抗氧化活性明顯增強[11]，但有關(guān)輪葉黨參對化學(xué)致癌物DEN的早期肝臟損傷的保護(hù)作用尚未見報道。本實驗旨在探討發(fā)酵輪葉黨參皂苷(fermentedCodonopsis lanceolatasaponin，F(xiàn)CLS)對DEN致小鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機制，以期能為肝癌化學(xué)預(yù)防劑的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輪葉黨參采集自吉林省延邊州安圖縣。

DEN 日本半井化學(xué)藥品株式會社；肝細(xì)胞中的細(xì)胞色素P4502E(CYP2E)抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒、SABC免疫組化試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；小鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA試劑盒、8-羥基鳥嘌呤-DNA糖苷酶(OGG1)ELISA試劑盒 上海研生生物科技有限公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀 南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司；小動物IVC飼養(yǎng)系統(tǒng) 蘇杭科技器材有限公司；BM-VI生物組織冷凍包埋機 孝感電子儀器廠；RM2125切片機 萊卡公司；BH2生物顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 FCLS的制備

輪葉黨參采用活性酵母發(fā)酵，F(xiàn)CLS的制備方法同俞星等[12]的報道。新鮮輪葉黨參，洗凈浮土，切成2～3cm薄片，在60℃條件下烘干，粉碎成20目的粗粉，用活性酵母發(fā)酵6d[13]，用50%乙醇加熱回流提取，濾液回收乙醇后減壓濃縮，用乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取，將后者上D10l大孔吸附樹脂，依次用30%、50%、75%和95%乙醇洗脫，合并洗脫液，回收乙醇，減壓干燥得到FCLS，采用香草醛-冰醋酸比色法測定總皂苷含量達(dá)到63%，其主要成分為Codonolaside、Lancemaside、刺囊酸等五環(huán)三萜類皂苷，其苷元為齊墩果酸。輪葉黨參經(jīng)活性酵母發(fā)酵之后，總皂苷含量達(dá)到7.34%(未發(fā)酵輪葉黨參總皂苷含量為3.52%)，故本實驗采用發(fā)酵方法處理后提取總皂苷。

1.3.2 動物分組及處理

雄性清潔級昆明種小鼠50只，體質(zhì)量20～22g，由延邊大學(xué)實驗動物科提供，在本實驗室IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進(jìn)行實驗。實驗前先將動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，然后隨機分為陰性對照組、單純DEN組(隔日腹腔注射DEN 20mg/kg，以體質(zhì)量計)、FCLS高、中、低3個劑量組(分別灌胃200、100、50mg/(kg·d)，以體質(zhì)量計)，連續(xù)6周。

1.3.3 OGG1活性及8-OHdG含量測定

在最后1次給藥后過24h，脫頸椎處死小鼠，每只小鼠取100mg左葉肝組織，加0.9mL生理鹽水用冰浴勻漿，3000×g離心30min后取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。肝組織勻漿蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.4 肝組織中CYP2E1免疫組織化學(xué)染色

動物脫頸椎處死后，取肝臟。切取長寬不超過5mm，厚度不超過2mm的組織塊，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。CYP2E1表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組織化學(xué)法(SP法)，DAB顯色，一抗CYP2E-BAl774為兔來源的多克隆抗體，工作濃度為1:100，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。每次實驗均設(shè)陰性對照，以PBS替代一抗，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)：CYP2E1陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿/胞膜呈棕黃色。每份切片取5個高倍視野(×400)，按以下方法進(jìn)行半定量的計數(shù)方法：0級為陽性細(xì)胞數(shù)為0%～5%，Ⅰ級為陽性細(xì)胞數(shù)為6%～25%或染色強度較弱，棕褐色不明顯。Ⅱ級為陽性細(xì)胞數(shù)為26%～50%，染色強度較深，棕褐色較明顯。Ⅲ級為陽性細(xì)胞數(shù)＞50%，染色強度深，棕褐色明顯。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料的顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。CYP2E1表達(dá)結(jié)果顯著性檢驗采用秩和檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝組織8-OHdG、OGG1含量

表1 各組肝勻漿中8-OHdG含量及OGG1活性比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

表1 各組肝勻漿中8-OHdG含量及OGG1活性比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

注：*.與陰性對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；#.與DEN組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與DEN組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 8-OHdG含量/(ng/L) OGG1含量/(pg/mL)陰性對照組 38.699±5.959 18.994±4.231 DEN組 54.979±4.688** 13.368±0.600*FCLS低劑量組 50.963±15.313 16.552±1.420##FCLS中劑量組 46.579±4.208## 18.026±3.705#FCLS高劑量組 45.488±2.360## 19.841±2.779##

由表1可知，DEN組肝組織勻漿中8-OHdG含量明顯高于陰性對照組(P＜0.01)；FCLS高、中劑量組肝組織8-OHdG含量明顯低于DEN組，其差異極顯著(P＜0.01)，并隨著FCLS劑量的增高，8-OHdG含量也隨之減少。DEN組肝組織勻漿中OGG1含量明顯低于陰性對照組(P＜0.05)，F(xiàn)CLS高、中、低3個劑量組肝組織勻漿中OGG1含量明顯高于DEN組，其差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，給藥劑量與OGG1活性呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 肝組織CYP2E1表達(dá)

圖1 小鼠肝臟CYP2E1蛋白表達(dá)(SP，×400)Fig.1 Expression of CYP2E1 protein in hepatic tissue (SP，×400)

免疫組化顯示棕黃色顆粒為CYP2E1蛋白表達(dá)陽性。由圖1可知，在陰性對照組中CYP2E1表達(dá)陽性細(xì)胞在腺泡Ⅲ區(qū)分布很少，單純給予DEN組CYP2E1表達(dá)陽性細(xì)胞從腺泡Ⅲ區(qū)延伸到腺泡Ⅱ區(qū)，而給予高劑量和中劑量FCLS的兩個組CYP2E1表達(dá)陽性細(xì)胞主要分布在腺泡Ⅲ區(qū)。統(tǒng)計評定結(jié)果如表2所示，DEN組肝組織中CYP2E1蛋白表達(dá)陽性率明顯高于陰性對照組(P＜0.01)；FCLS中劑量組和高劑量組肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)陽性率明顯低于DEN組，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 肝組織中CYP2E1蛋白表達(dá)的變化Table 2 Comparison of CYP2E1 protein expression in hepatic tissue from different groups

3 討 論

有研究報道[14]，在DEN誘發(fā)小鼠肝癌實驗中，給予DEN第4、6周時，小鼠肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD133 mRNA的表達(dá)與對照組無差異，第8周CD133 mRNA的表達(dá)顯著高于對照組，因此DEN誘發(fā)小鼠肝癌的過程中，第1～6周的病理變化主要是藥物性肝炎的表現(xiàn)，包括部分肝細(xì)胞出現(xiàn)增生性改變，局部肝細(xì)胞的變性壞死和充血及出血。此階段尚未形成肝癌細(xì)胞，應(yīng)是肝癌預(yù)防的最佳階段。本實驗的前期研究結(jié)果表明輪葉黨參皂苷能明顯提高腹腔注射DEN 6周的小鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)活性，并顯著降低MDA含量，并減少DEN所致肝細(xì)胞DNA鏈斷裂[15]，表明FCLS具有明顯的提高抗氧化酶活性作用。8-OHdG是鳥嘌呤的氧化型，是由于DNA鏈上鳥嘌呤堿基的C-8位受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊，發(fā)生羥化而生成[16-17]，其結(jié)果導(dǎo)致G:C突變?yōu)門:A的DNA堿基顛換[18]。在臨床和實驗中8-OHdG常用作檢測DNA氧化損傷、突變的重要生物標(biāo)志物[19]。本研究結(jié)果表明，小鼠隔日注射DEN，連續(xù)6周，導(dǎo)致肝組織8-OHdG含量明顯高于對照組，表明DEN導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞DNA氧化損傷。給予DEN的同時灌胃不同劑量的FCLS，肝組織8-OHdG含量明顯低于單純DEN組，且存在劑量依存性，表明FCLS能夠拮抗DEN對肝細(xì)胞DNA的氧化損傷作用。由于DEN已被證明誘發(fā)動物肝硬變及肝癌，因此可推測FCLS對DEN誘發(fā)肝癌具有潛在的預(yù)防作用。

當(dāng)DNA分子受自由基攻擊而發(fā)生氧化損傷時，機體可通過自身修復(fù)機制修補受損的DNA分子，從而維持DNA的穩(wěn)定性。機體內(nèi)多種DNA氧化損傷修復(fù)方式中堿基切除修復(fù)是最重要的修復(fù)途徑，因為自由基主要引起非烷基化DNA損傷，該損傷的修復(fù)需要堿基切除修復(fù)酶。OGG1是參與堿基切除修復(fù)過程的重要酶之一，并且在修復(fù)的過程中與個體對致癌物作用的敏感性密切相關(guān)。無論是OGG1基因突變或缺失，都能使細(xì)胞修復(fù)8-OHdG的能力降低或喪失，并且對個體患腫瘤的風(fēng)險也隨之增高[20]。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者OGG1基因表達(dá)顯著低于健康人，且OGG1基因表達(dá)降低可使患頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險提高2倍以上[21]。本研究結(jié)果表明，單純DEN組小鼠肝組織OGG1活性明顯低于陰性對照組，而給予FCLS的小鼠肝組織OGG1活性明顯高于單純DEN組，表明DEN抑制小鼠肝細(xì)胞OGGl活性，減弱對氧化損傷的DNA的修復(fù)能力。用FCLS干預(yù)后通過上調(diào)OGGl的活性，提高切除DNA雙鏈中的8-OHdG，恢復(fù)基因組中正常的G:C配對，使受損DNA得到修復(fù)。本研究結(jié)果中，F(xiàn)CLS高劑量組的OGG1活性略高于正常對照組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此認(rèn)為FCLS在本實驗條件下不發(fā)生OGG1過表達(dá)。

細(xì)胞色素P450(CYP)是研究較多的Ⅰ相代謝酶，作為肝臟主要代謝酶，該酶系有100多種同工酶，其中細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)約占P450總量的7%，CYP2E1作為肝臟的重要代謝酶參與其發(fā)生發(fā)展，對乙醇、亞硝胺等肝毒性物質(zhì)具有特異性的代謝作用，但其過表達(dá)可促進(jìn)各種肝病的發(fā)生，并參與了多種消化道和呼吸道腫瘤的形成[22]。在外源性化合物和藥物代謝的過程中，CYP2E1可把無活性的前致癌物代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橛H電子化學(xué)物，親電子化學(xué)物可以攻擊細(xì)胞內(nèi)的大分子，與DNA或蛋白質(zhì)形成加成物，最終引起病變[23]。研究表明，CYP2E1參與肝毒性物質(zhì)的活化，使前毒性物質(zhì)或致癌物質(zhì)與嗜電子衍生物結(jié)合，引起細(xì)胞毒性、死亡甚至癌變[24]。

本研究結(jié)果表明，與陰性對照組相比，DEN組細(xì)胞的CYP2E1蛋白表達(dá)增加，CYP2E1活性增強。該結(jié)果證實了DEN誘導(dǎo)CYP2E1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，使CYP2E1活性增強，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化增加，抗氧化物質(zhì)減少。與DEN組相比，同時給予FCLS組肝細(xì)胞CYP2E1蛋白表達(dá)降低，說明FCLS可以抑制DEN誘導(dǎo)的CYP2E1活性的上調(diào)引起的反應(yīng)性氧自由基產(chǎn)生的增多及其引起的代謝毒性。

Kim等[25]報道，用乳酸菌發(fā)酵輪葉黨參前后的提取物對人類癌細(xì)胞生長抑制作用表現(xiàn)出明顯的差異，即生輪葉黨參提取物對人胃癌及乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用優(yōu)于發(fā)酵輪葉黨參提取物，而發(fā)酵輪葉黨參提取物對人肝癌和肺癌細(xì)胞的生長抑制作用明顯優(yōu)于生輪葉黨參，并認(rèn)為其抑癌作用主要依賴于三萜皂苷。俞星等[12]用活性酵母發(fā)酵輪葉黨參后提取總皂苷，進(jìn)行體外實驗結(jié)果表明，輪葉黨參總皂苷能明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG-2的增殖，并通過提高促進(jìn)凋亡基因蛋白Caspase3,8,9活性，誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡。通過本次研究及已有的研究，認(rèn)為經(jīng)過活性酵母發(fā)酵的輪葉黨參總皂苷提取物。本次實驗結(jié)果表明輪葉黨參經(jīng)活性酵母發(fā)酵提取的輪葉黨參皂苷對DEN誘發(fā)小鼠肝細(xì)胞DNA氧化損傷具有較好的預(yù)防作用，提示輪葉黨參通過微生物發(fā)酵，其皂苷對肝癌具有一定的預(yù)防作用。關(guān)于輪葉黨參經(jīng)微生物發(fā)酵后某些藥理活性的變化機制尚未見研究報道，有待于今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)CLS預(yù)防DEN致小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的機制為通過降低CYP2E1活性，降低DEN在肝組織中的活化，通過提高抗氧化酶活性，清除DEN代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基和活性氧，從而阻止了肝細(xì)胞DNA的氧化損傷。同時通過提高OGG1基因表達(dá)，迅速清除DNA氧化損傷產(chǎn)生的加合物8-OHdG，修復(fù)受損DNA。

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