陳伶利，李 杰

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

細(xì)菌耐藥性是指細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的相對(duì)抗性。如果從弗萊明1929年發(fā)表《論青霉菌培養(yǎng)物的抗菌作用》論文算起，抗菌藥物與病菌之間的“拉鋸戰(zhàn)”已有80年。人類為了對(duì)付層出不窮的致病微生物，不斷研發(fā)出各類新型抗菌藥物。而細(xì)菌為了生存，不斷變異進(jìn)化，形成可耐受多種抗菌藥物的多重耐藥細(xì)菌，典型的代表菌如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等[1]。細(xì)菌耐藥性已成為21世紀(jì)全球關(guān)注的熱點(diǎn)，我們主要對(duì)大腸埃希菌外排系統(tǒng)與多重耐藥最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、大腸埃希菌的耐藥機(jī)制

細(xì)菌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，從遺傳學(xué)角度來說，細(xì)菌的耐藥分為固有性耐藥和獲得性耐藥。前者來源于該細(xì)菌本身染色體上的耐藥基因，代代相傳，具有典型的種屬特異性;而后者是由于細(xì)菌在生長繁殖過程中，其DNA發(fā)生改變而使其形成或獲得了耐藥性表型，介導(dǎo)DNA改變的因素包括染色體突變和質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等介導(dǎo)的耐藥基因的獲得。一直以來，人們都認(rèn)為細(xì)菌的耐藥性是隨著抗菌藥物的使用而后天獲得的一種能力，但是最新的研究表明，這種能力是先于現(xiàn)代抗菌藥物選擇壓力之前細(xì)菌本身所固有的。來自加拿大麥克馬斯特大學(xué)的研究人員在距今3萬年以前的古細(xì)菌體內(nèi)，首次發(fā)現(xiàn)了多種抗菌藥物的耐藥基因[2]。但耐藥基因是如何轉(zhuǎn)移的，還有待于研究。

細(xì)菌的耐藥可由滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生、細(xì)胞膜通透性的改變、藥物作用靶位的改變、細(xì)菌自身代謝狀態(tài)改變、細(xì)菌生物被膜的形成、多重藥物外排機(jī)制等多因素引起。對(duì)于細(xì)菌來說，外排基因占所有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的6% ～18%，所以外排基因編碼的外排泵是導(dǎo)致其多重耐藥的重要機(jī)制。如最新研究表明結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼和乙氨丁醇的耐受就是由一種藥物外排基因jefA引起的[3]。而耐藥菌株陰溝腸桿菌對(duì)喹諾酮的抗性也是由多藥及毒性化合物外排家族(mutidrug and toxic compound extrusion，MATE)主動(dòng)外排藥物所介導(dǎo)[4]。對(duì)于大腸埃希菌來說，其表達(dá)的AcrABTolC外排泵更是被作為外排系統(tǒng)的經(jīng)典模型來研究。研究結(jié)果也表明，臨床分離的多重耐藥的大腸埃希菌，其耐藥性往往與某些基因的超表達(dá)相關(guān)，而這些基因是調(diào)控多重藥物外排泵的轉(zhuǎn)錄因子，能上調(diào)多重藥物外排泵AcrAB-TolC和下調(diào)膜蛋白的通透性[5-6]。所以，以下我們將詳細(xì)介紹引起大腸埃希菌多重耐藥的外排系統(tǒng)。

二、大腸埃希菌主動(dòng)外排泵

細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜，從細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)化與功能角度來看，與抗菌藥物耐藥性有關(guān)的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)主要?dú)w為以下5個(gè)家族:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結(jié)合盒超家族(ATP-binding cassettes[ABC]transporters，ABC)、小多重耐藥家族(small multidrug resistance，SMR)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、MATE和耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族(resistance nodulation cell division，RND)[7]。以上各類轉(zhuǎn)運(yùn)體中，除ABC家族以ATP作為能源外排藥物，MATE家族以鈉離子或質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能量外，其余各類均以質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力為能量并形成質(zhì)子與藥物的反轉(zhuǎn)運(yùn)體，即質(zhì)子與藥物在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，質(zhì)子進(jìn)入胞內(nèi)而藥物被排至胞外。以下將對(duì)每個(gè)外排家族的功能進(jìn)行介紹。

1.ABC ABC家族能介導(dǎo)一系列藥物的外排。細(xì)菌中很多外排泵屬于這一類型，如金黃色葡萄球菌的 AbcA、Sav1866，鼠傷寒沙門菌的MacAB，肺炎鏈球菌的PatA、PatB、SP2073/SP2075，結(jié)核分枝桿菌的 Rv0194、Rv1258C、Rv2686c、Rv2687c、Rv2688c等。對(duì)于大腸埃希菌來說，2005年Salomón帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)屬于 ABC 的外排泵——YojI[8]，雖然該外排泵的具體結(jié)構(gòu)還不是很清楚，但研究結(jié)果表明，其與外膜蛋白TolC聯(lián)合后可介導(dǎo)多肽類抗菌藥物小菌素J25的外排[9]。亮氨酸應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白能誘導(dǎo)YojI的表達(dá)，如果亮氨酸應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白被抑制，則會(huì)導(dǎo)致YojI表達(dá)受阻。最近在嗜麥芽窄食單胞菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)ABC外排家族的新成員，命名為SmrA，該外排泵能增加大腸埃希菌對(duì)氟喹諾酮類、四環(huán)素、阿霉素及多種染料分子等物質(zhì)的抗性，甚至還能減少大腸埃希菌對(duì)諾氟沙星的攝入及增加其外排[10]。

2.SMR SMR家族的成員超過250個(gè)，在這些外排成員中，有的是由染色體編碼，如在鮑曼不動(dòng)桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AbeS[11]，也有的是由質(zhì)粒編碼。SMR主要外排一些殺毒劑以及氨基糖苷類抗菌藥物。大腸埃希菌的EmrE是SMR的典型外排泵，其是一個(gè)由4個(gè)穿膜蛋白構(gòu)成的同源二聚體并以此形式來發(fā)揮作用。雖然EmrE外排泵只能將其底物分子外排到其膜間隙，但其與AcrAB-TolC之類的RND外排泵聯(lián)合作用仍然可以引起對(duì)底物分子的超強(qiáng)耐受性。在大腸埃希菌中還存在很多SMR外排泵如Mef(B)、QepA、QepA2等，他們都是由質(zhì)粒編碼的外排泵，前者可以外排一些重金屬鹽[12]，而后兩者都能介導(dǎo)氟喹諾酮類藥物的耐藥[13-14]。

3.MFS 這也是一個(gè)很龐大的家族，細(xì)菌的很多外排泵都有此家族，包括鮑曼不動(dòng)桿菌的SmvA、幽門螺桿菌的 Hp1181、枯草芽孢桿菌的Bmr和LmrB、金黃色葡萄球菌的 NorA和 QacA等。關(guān)于MFS的最新研究是在鮑曼不動(dòng)桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的MFS外排家族成員AmvA，其能介導(dǎo)藥物及殺菌劑的外排[15]。這些外排泵多數(shù)屬于逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白單體，但在革蘭陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的MFS外排泵卻屬于由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白共同組成的三聯(lián)復(fù)合體，大腸埃希菌的EmrAB-TolC和EmrKY-TolC就是其中的典型代表。這種復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制比起單個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率要高一些，因?yàn)閱蝹€(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白僅能將底物分子運(yùn)送到膜的周質(zhì)空間，然后再由別的外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)出去。目前已有很多MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常清楚，如大腸埃希菌多重耐藥外排泵EmrD，其能介導(dǎo)一系列疏水性分子的外排，如十二烷基磺酸鈉、苯甲羥氨等。在霍亂弧菌體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了EmrD-3外排泵，將該外排泵基因重組到大腸埃希菌體內(nèi)能明顯增加細(xì)胞對(duì)藥物的耐受能力，其中對(duì)利奈唑酮的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值升高最明顯，可達(dá) 102 倍(MIC=256 mg/mL)[16]。結(jié)構(gòu)研究表明，在EmrD內(nèi)部有一個(gè)由疏水殘基構(gòu)成的疏水性很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，并向細(xì)胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)伸出2個(gè)長環(huán)結(jié)構(gòu)，該環(huán)能識(shí)別底物分子[17]。

4.MATE 這個(gè)家族能介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)一系列包括氟喹諾酮類在內(nèi)的陽離子毒性藥物的耐受，但他的底物類型卻比其他外排家族少很多。要通過質(zhì)子或鈉離子與藥物的反向轉(zhuǎn)運(yùn)來提供能量。以副溶血性弧菌NorM外排泵為代表[18]，雖然目前報(bào)道的MATE家族成員大約只有20個(gè)，但是幾乎在所有生物體內(nèi)都存在MATE蛋白，如在人類染色體上就發(fā)現(xiàn)了編碼MATE蛋白的基因hMATE1和 hMATE17，將hMATE1在HEK293細(xì)胞中表達(dá)后，能介導(dǎo)有機(jī)陽離子和質(zhì)子的交換[19]。

5.RND RND外排家族是廣泛分布在革蘭陰性細(xì)菌體內(nèi)的一類外排系統(tǒng)，其能主動(dòng)外排抗菌藥物和一些化學(xué)試劑。有研究顯示RND的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥性密切相關(guān)。大腸埃希菌中此家族包括7個(gè) RND轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中AcrAB、AcrEF、AcrD、YhiUV、MdtABC 與藥物的排出有關(guān)，他們都需與外膜蛋白TolC聯(lián)合，并通過TolC的開放外排不同的藥物分子[20]。AcrABTolC外排系統(tǒng)是大腸埃希菌中最重要的外排系統(tǒng)，在大腸埃希菌的先天性耐藥中起著顯著的作用。近年來對(duì)他的結(jié)構(gòu)和外排機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。AcrAB-TolC外排泵是由3個(gè)配體蛋白構(gòu)成的三聯(lián)體復(fù)合物，包括位于細(xì)胞內(nèi)膜上的“輸送器”(AcrB)、錨定在外膜上的“出口通道”(TolC)以及橫跨周質(zhì)空間的“轉(zhuǎn)接蛋白AcrA”[21-22]。AcrA通過脂肪酸鏈連接在內(nèi)膜上，并通過發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接在“出口導(dǎo)管”的雙螺旋區(qū)域。他的作用主要是協(xié)調(diào)AcrB和TolC之間的相互作用，Tikhonova等[23]采用表面等離子體技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AcrA上與細(xì)胞膜鄰近的結(jié)構(gòu)域部分的構(gòu)象對(duì)AcrAB-TolC復(fù)合體的形成至關(guān)重要，并將作為新的抑制劑研發(fā)的靶點(diǎn)。內(nèi)膜蛋白AcrB能識(shí)別外排藥物，并通過構(gòu)象改變形成質(zhì)子和藥物分子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的能量轉(zhuǎn)化體[24]，他與藥物分子具有很高的親和性，其基因的突變會(huì)導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)鄰氯青霉素MIC值下降512倍[25]。除此以外，AcrB還能與新生霉素、MC-207110等外排泵抑制劑結(jié)合，但此結(jié)合并不會(huì)影響其與AcrA、TolC的相互作用[23]。外膜蛋白TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結(jié)構(gòu)，以便給外排底物提供泵出的寬闊通道;下端為封閉結(jié)構(gòu)。三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC錯(cuò)誤的開放會(huì)引起他們?nèi)呦嗷プ饔玫臏p弱甚至三聯(lián)復(fù)合物的解體[26]。TolC除了在外排藥物中發(fā)揮作用外，研究還發(fā)現(xiàn)其與大腸埃希菌耐受極酸性環(huán)境有關(guān)[26]。在對(duì)大腸埃希菌AcrAB-TolC的外排路徑的研究中發(fā)現(xiàn)，AcrB識(shí)別藥物分子，并引起其構(gòu)象改變，形成一條藥物分子進(jìn)出的通道，AcrB構(gòu)象的改變會(huì)帶動(dòng) AcrA和TolC相互作用，開放TolC通道。DARPin能抑制AcrA與AcrB的相互作用，從而引起通道TolC錯(cuò)誤的開放，使他們?nèi)呦嗷プ饔脺p弱甚至復(fù)合物的解體[23]。對(duì)于藥物分子而言，他們先與 AcrB的“較低裂縫 ”部位結(jié)合，然后通過“結(jié)合口袋”運(yùn)輸?shù)健巴ǖ来箝T”，最后到達(dá)連接AcrB與TolC的“漏斗部位”，經(jīng)TolC通道排出細(xì)胞[27]。

三、展望

大腸埃希菌是重要的條件致病菌，其外排系統(tǒng)在其多重耐藥中起到非常重要的作用。在過去10多年中，人們主要對(duì)大腸埃希菌外排泵的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。隨著研究的深入，新外排泵不斷被開發(fā)，外排泵的結(jié)構(gòu)不斷被破解，這對(duì)解決日益嚴(yán)重的耐藥問題具有重要的意義。在這些研究中，很少有針對(duì)外排泵分子機(jī)制的研究，如果更多地關(guān)注外排泵的三維結(jié)構(gòu)、外排泵-底物復(fù)合物的合成以及動(dòng)力學(xué)特征的研究，將有助于選擇外排機(jī)制中的新目標(biāo)，從而開發(fā)出具有臨床意義的耐藥性抑制劑。

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