王玉嬌， 趙文璽， 金梅花， 李 天， 全吉淑

（延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

大豆皂苷是大豆重要生物活性物質(zhì)之一，主要分布于大豆胚軸中。大豆皂苷屬于五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂苷，由非極性的三萜苷元和低聚糖鏈組成。按苷元的不同可分為A類、B類、E類和DDMP皂苷，其中A類為雙糖鏈皂苷，B類、E類和DDMP皂苷為單糖鏈皂苷[1]。大豆皂苷具有多種藥理作用，如抗氧化、抗癌、防治心血管疾病及免疫激活等作用[2-4]。最近研究還表明，大豆皂苷及其衍生物對半刀豆球蛋白A所致肝損傷以及酒精性急性肝損傷具有保護(hù)作用[5-7]。作者通過建立四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，觀察大豆皂苷對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激的干預(yù)作用，探討大豆皂苷的保肝作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明小鼠，雄性，體重為18～22 g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和儀器 大豆皂苷（純度≥80%）:華北制藥股份有限公司；CCl4:Sigma公司；水飛薊素:沈陽東陵藥業(yè)股份有限公司；白蛋白（Alb）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、還原型谷胱甘肽（GSH）、Na+-K+-ATP 酶 （Na+-K+-ATPase）、Ca2+-Mg2+-ATP 酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）、Mn-超氧化物歧化酶 （Mn-SOD）、丙二醛（MDA）及蛋白質(zhì)試劑盒:南京建成科技有限公司；3-30K型離心機(jī):德國Sigma公司；S22PC型分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將50只小鼠按體重隨機(jī)分為5組，即正常對照組、模型對照組、水飛薊素組、大豆皂苷高、低劑量組。每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，水飛薊素劑量為50 mg/kg，大豆皂苷高、低劑量分別為200、100 mg/kg，正常對照組及模型對照組小鼠則以等體積生理鹽水灌胃。末次給藥1 h后，除正常對照組腹腔注射等體積大豆油外，其余各組小鼠腹腔注射給予40 mg/kg CCl4（注射體積分?jǐn)?shù)為0.5%的CCl4大豆油5 mL/kg）。造模期間禁食，不禁水。

1.2.2 血清生化指標(biāo)的檢測 造模16 h后，分離血清，檢測小鼠血清Alb含量和ALT、AST、ALP活性，并按公式計算藥物對Alb含量的提高率和對酶活性的抑制率。

提高率（%）=（治療組模型-對照組）／（正常對照組-模型對照組）×100

抑制率（%）=（模型對照組-治療組）／（模型對照組-正常對照組）×100

1.2.3 肝組織氧化應(yīng)激及抗氧化指標(biāo)的檢測 常規(guī)方法制備肝勻漿和肝線粒體。按照各測試盒操作方 法 測 定 SOD、CAT、GPx、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Mn-SOD、GSH、MDA 及蛋白質(zhì)水平，并按上述公式計算各指標(biāo)的提高率或抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆皂苷對肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP活性和Alb含量的影響

血清ALT、AST、ALP活性和Alb含量可反映肝功能損傷急性期改變以及肝細(xì)胞損傷程度[8-9]，見表1。與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT、AST和ALP活性明顯升高 （P＜0.05），Alb含量明顯減少（P＜0.05），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功；與模型對照組比較，大豆皂苷高、低劑量組小鼠血清ALT活性明顯降低（P＜0.05），大豆皂苷高劑量組血清 AST和ALP活性明顯降低（P＜0.05），Alb含量明顯增高（P＜0.05），提示大豆皂苷對CCl4所致肝損傷具有保護(hù)作用。大豆皂苷高劑量組對血清ALT、AST和ALP活性的抑制率分別為 76%、65%和67%，Alb含量的提高率為75%，接近或超過水飛薊素組的85%、67%、59%和69%，說明其保肝活性基本接近水飛薊素。

表1 大豆皂苷對血清 ALT、AST、ALP活性和 Alb含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of soyasaponins on ALT，AST，ALP activities and Alb content of serum（±s，n=10）

表1 大豆皂苷對血清 ALT、AST、ALP活性和 Alb含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of soyasaponins on ALT，AST，ALP activities and Alb content of serum（±s，n=10）

注:與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組大豆皂苷低劑量組大豆皂苷高劑量組水飛薊素組劑量/(mg/kg)--100 200 50 ALT/(U/L)31.9±6.2 55.2±8.4*42.3±7.2#37.4±6.1#35.2±8.2#AST/(U/L)71.4±13.9 92.7±15.8*86.1±16.7 80.2±9.6#79.5±9.1#ALP/(U/L)121±18 174±22*152±21 138±18#133±19#Alb/(g/dL)7.4±1.3 5.7±0.9*6.5±1.1 6.9±1.0#6.8±1.0#

2.2 大豆皂苷對肝損傷小鼠肝組織抗氧化體系的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物。SOD、GPx和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可與GSH等抗氧化劑一起能有效清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，使機(jī)體免受自由基的損害[8-10]。注射CCl4明顯降低模型對照組小鼠肝勻漿 SOD、GPx 和 GSH 水平（P＜0.05），升高肝勻漿MDA含量（P＜0.05），說明CCl4所致的急性肝損傷能引起典型脂質(zhì)過氧化損傷。大豆皂苷治療可回升小鼠肝勻漿SOD、GPx活性和GSH含量（P＜0.05），降低 MDA 水平（P＜0.05）。 大豆皂苷高、低劑量組小鼠肝勻漿MDA水平分別降低59%和72%，高劑量組MDA抑制率接近水飛薊素組的74%。與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝組織CAT水平?jīng)]有顯著性變化，但大豆皂苷和水飛薊素干預(yù)則可明顯增高小鼠肝組織CAT活性（P＜0.05），見表2。

表 2 大豆皂苷對肝勻漿 SOD、CAT、GPx、GSH 及 MDA 水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of soyasaponins on SOD，CAT，GPx，GSH and MDA of liver homogenates（±s，n=10）

表 2 大豆皂苷對肝勻漿 SOD、CAT、GPx、GSH 及 MDA 水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of soyasaponins on SOD，CAT，GPx，GSH and MDA of liver homogenates（±s，n=10）

注:與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組大豆皂苷低劑量組大豆皂苷高劑量組水飛薊素組劑量/(mg/kg)--100 200 50 SOD/(U/mg)191±14 154±9.7*186±15#205±22#206±23#CAT/(U/mg)8.2±1.6 8.9±1.4 10.2±1.0 12.2±1.4#12.3±1.1#GPx/(U/mg)397±43 263±49*302±41 344±48#351±34#GSH/(nmol/mg)29.7±3.1 18.1±2.0*23.7±2.4#25.8±2.9#24.9±2.1#MDA/(nmol/mg)2.12±0.32 3.17±0.30*2.56±0.27#2.42±0.27#2.38±0.25#

2.3 大豆皂苷對肝損傷小鼠肝線粒體氧化應(yīng)激的影響

氧化應(yīng)激的主要作用靶點之一是線粒體，而SOD是線粒體主要抗氧化酶，以Mn-SOD形式存在[11]。此外，線粒體功能障礙是肝細(xì)胞損傷的一個重要機(jī)制，它在細(xì)胞壞死和凋亡過程中都起著重要作用，已成為細(xì)胞存亡的控制中心。Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于線粒體膜上的重要ATP酶，是反映細(xì)胞能量代謝及功能損傷的重要指標(biāo)[10，12]，見表 3。與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝線粒體MDA含量增高（P＜0.05），肝線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和 Mn-SOD活性降低（P＜0.05），說明CCl4引起急性肝損傷小鼠肝線粒體氧化應(yīng)激，線粒體功能受到損傷。大豆皂苷治療可回升小鼠肝線粒體 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和 Mn-SOD活性 （P＜0.05）， 降低線粒體MDA水平（P＜0.05）。大豆皂苷高劑量組線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和Mn-SOD活性分別升高52%、83%和68%，接近水飛薊素組的61%、82%和41%，肝線粒體MDA水平則降低85%，高于水飛薊素組的83%。說明大豆皂苷可減輕肝損傷小鼠的肝線粒體氧化應(yīng)激，提高線粒體抗氧化能力，有助于改善線粒體功能障礙。

表 3 大豆皂苷對肝線粒體 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Mn-SOD 及 MDA 的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of soyasaponins on Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase，Mn-SOD and MDA of liver mitochondria（±s，n=10）

表 3 大豆皂苷對肝線粒體 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Mn-SOD 及 MDA 的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of soyasaponins on Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase，Mn-SOD and MDA of liver mitochondria（±s，n=10）

注:與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/(mg/kg)MDA/(nmol/mg) Mn-SOD/(U/mg) Na+-K+-ATPase/(U/mg) Ca2+-Mg2+-ATPase/(U/mg)正常對照組 - 2.65±0.60 152±12 6.5±1.2 8.7±1.1模型對照組 - 3.97±0.71* 112±11* 4.2±0.6* 6.9±0.8*大豆皂苷低劑量組 100 3.12±0.55# 132±15# 4.7±0.8 7.8±0.6大豆皂苷高劑量組 200 2.84±0.57# 139±14# 5.4±0.7# 8.4±0.9#水飛薊素組 50 2.87±0.52# 128±13# 5.6±0.7# 8.4±0.8#

3 結(jié)語

肝損傷是指在一系列理化因素的作用下，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡的病理狀態(tài)。在肝細(xì)胞病變過程中，自由基、酶及脂質(zhì)過氧化等均發(fā)揮主要作用[13]。CCl4所致急性肝損傷模型是最常用的經(jīng)典模型之一，其機(jī)制為CCl4在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P450分解活化，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基，導(dǎo)致肝微粒體的脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)而抗氧化能力下降，導(dǎo)致自由基增加，細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損害[14]。文獻(xiàn)報道大豆皂苷具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化活性，因而推測其可能具有保肝作用。作者選擇血清ALT、AST、ALP和Alb等指標(biāo)評價CCl4造成急性肝損傷的程度。本實驗結(jié)果表明，大豆皂苷均可明顯降低CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和ALP活性，增高血清Alb含量，提示大豆皂苷可減輕CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和改善肝臟功能狀況。

肝損傷是多種肝病共同的病理基礎(chǔ)，而活性氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是肝病發(fā)病的共同病理生理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激主要通過啟動膜脂質(zhì)過氧化改變生物膜功能、與生物大分子共價結(jié)合及破壞酶的活性等在細(xì)胞因子，如TNF-α、NF-κB等的共同作用下引起不同程度的肝損傷。因此，對氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的研究便成為治療肝臟疾病的一個重要途徑[15]。機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類與其它酶類及抗氧化劑組成一個抗氧化防御系統(tǒng)，以清除體內(nèi)過多的自由基。SOD消除單線態(tài)氧，是抗氧化的第一道防線；而CAT和GPx清除H2O2，從而減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的引發(fā)。GSH是一種低分子自由基清除劑，又是GPx的底物，且能穩(wěn)定巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷[16]。本實驗表明，模型對照組小鼠肝臟抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化水平升高，提示大豆皂苷可通過直接捕捉、清除自由基、阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，最終抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成。

線粒體在細(xì)胞代謝和能量過程扮演著重要的角色，由于線粒體內(nèi)膜的高選擇性，線粒體較獨立于外界環(huán)境，只有在能量吸收和轉(zhuǎn)換過程中受到外界環(huán)境的影響，產(chǎn)生線粒體氧應(yīng)激損傷。由于線粒體在細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝過程中的重要性，線粒體形成了自身的一套抗氧化防御體系，保證細(xì)胞的能量和物質(zhì)代謝順利進(jìn)行。線粒體內(nèi)的抗氧化物包括低分子量的活性氧清除劑，如GSH和催化降解過氧化物和氫過氧化物的有關(guān)的酶，包括Mn-SOD、GPx等[11]。此外，自由基與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)還損傷線粒體膜，使其伴有ATP酶活性降低。本實驗表明，模型對照組小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，Mn-SOD活性降低，MDA水平升高，表明急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞線粒體能量代謝障礙及鈣泵活性降低，存在一定程度的線粒體氧應(yīng)激和功能損傷，這與文獻(xiàn)報道相一致[10，12]。CCl4進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生大量自由基，自由基與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體水腫和ATP合成減少，并伴有ATP依賴性酶的活性降低，而后者又能加重線粒體的損傷[10，12]。大豆皂苷可增高肝損傷小鼠肝線粒體抗氧化能力，減輕自由基對線粒體的損傷和改善線粒體功能障礙，從而對線粒體起到保護(hù)作用。

綜上所述，大豆皂苷降低CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟及其線粒體氧化應(yīng)激，對肝損傷具有保護(hù)作用。該研究結(jié)果對大豆皂苷在保肝方面的開發(fā)利用具有一定的參考價值。

[1]孫權(quán)，劉淑萍，金愛花，等.大豆皂甙體外抗氧化活性研究[J].食品科技，2010，35（3）:72-74.SUN Quan，LIU Shu-ping，JIN Ai-hua，et al.In vitro antioxidantive effects of soyasaponins[J].Food Science and Technology，2010，35（3）:72-74.（in Chinese）

[2]裴迎新，趙煥煥，杜曉燕，等.大豆皂甙Bb對食管癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究[J].衛(wèi)生研究，2010，39（4）:444-446.PEI Ying-xin，ZHAO Huan-huan，DU Xiao-yan，et al.Apoptosis effects on human esophageal cancer cells by soyasaponin Bb and its mechanism[J].Journal of Hygiene Research，2010，39（4）:444-446.（in Chinese）

[3]Zhang W，Popovich D G.Effect of soyasapogenol A and soyasapogenol B concentrated extracts on Hep-G2 cell proliferation and apoptosis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（8）:2603-2608.

[4]Rodrigues H G，Diniz Y S，F(xiàn)aine L A，et al.Antioxidant effect of saponin:potential action of a soybean flavonoid on glucose tolerance and risk factors for atherosclerosis[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition，2005，56（2）:79-85.

[5]Kuzuhara H，Nishiyama S，Minowa N，et al.Protective effects of soyasapogenol A on liver injury mediated by immune response in a concanavalin A-induced hepatitis model[J].European Journal of Pharmacology，2000，391（1-2）:175-181.

[6]Sasaki K，Minowa N，Kuzuhara H，et al.Preventive effects of soyasapogenol B derivatives on liver injury in a concanavalin A-induced hepatitis model[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2005，13（16）:4900-4911.

[7]楊修仕.大豆皂苷對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究[D].太原:山西大學(xué)，2011.

[8]QUAN Ji-shu，YIN Xue-zhe，XU Hui-xian.Boschniakia rossica prevents the carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rat[J].Experimental and Toxicologic Pathology，2011，63:53-59.

[9]劉小玲，李艷，趙鵬，等.仙草提取物對CCl4致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，28（6）:1-5.LIU Xiao-ling，LI Yan，ZHAO Peng，et al.Protective effects of extracts of Mesona blumes on carbon tetrachloride induced liver injury in mice[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（6）:1-5.（in Chinese）

[10]宋軍，趙軍寧，王曉東，等.芍甘多苷對四氯化碳亞急性肝損傷大鼠肝細(xì)胞線粒體保護(hù)作用[J].中國中藥雜志，2011，36（7）:931-937.SONG Jun，ZHAO Jun-ning，WANG Xiao-dong，et al.Protective effects of Shaoganduogan on hepatocyte mitochondria in subacute liver injury rat induced by carbon tetrachloride[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2011，36（7）:931-937.（in Chinese）

[11]邱小忠，陳瑗，周玫.線粒體氧應(yīng)激損傷的防御體系[J].生命的化學(xué)，2001，21（2）:141-143.QIU Xiao-zhong，CHEN Yuan，ZHOU Mei，et al.Defense system for oxidative stress-associated damage of mitochondrion[J].Chemistry of Life，2001，21（2）:141-143.（in Chinese）

[12]黃玉軍，陳霞，顧瑞霞，等.嗜熱鏈球菌grx02發(fā)酵乳對大鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用的實驗研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2012，34（2）:164-167，171.HUANG Yu-jun，CHEN Xia，GU Rui-xia，et al.The protective effects of streptococcus thermophilus grx02 fermented milk on alcoholic liver injury in rats[J].Acta Nutrimenta Sinica，2012，34（2）:164-167，171.（in Chinese）

[13]陳偉平，謝園沁，胡金鹿，等.紫心甘薯對四氯化碳、卡介苗加脂多糖誘發(fā)小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011，30（6）:887-893.CHEN Wei-ping，XIE Yuan-qin，HU Jin-lu，et al.Protective effect of purple sweet potato on hepatic injury mice[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（6）:887-893.（in Chinese）

[14]閆冰，丁安偉，張麗.二至丸提取物對小鼠四氯化碳急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志，2010，35（22）:3080-3083.YAN Bing，DING An-wei，ZHANG Li.Liver protection of Erzhi Wan extract on acute hepatic injury induced by CCl4in mice[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2010，35（22）:3080-3083.（in Chinese）

[15]Turrens J F.Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J].The Journal of Physiology，2003，552（2）:335-344.

[16]汪霞，周微，李天，等.草蓯蓉環(huán)烯醚萜對肝癌前病變大鼠血清標(biāo)志酶及抗氧化活性的影響[J].食品科技，2010，35（7）:242-245.WANG Xia，ZHOU Wei，LI Tian，et al.Effect of iridoid glucosides from Boschniakia rossica on serum marker enzymes and antioxidative activities of rat with hepatic preneoplasia[J].Food Science and Technology，2010，35（3）:72-74.（in Chinese）