李龍囡 ， 王艷艷 ， 尹彩娜 ， 王舒平 ， 孫 進(jìn) ， 樂國偉 1，， 施用暉 *1，

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

脂類是機(jī)體重要的營養(yǎng)和能量物質(zhì)，但長期高脂膳食將導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是引發(fā)高血脂癥、動脈粥樣硬化及肥胖等代謝疾病的根源[1-3]。脂代謝過程涉及載脂蛋白、脂蛋白受體等，而脂蛋白脂酶（LPL）和肝脂酶（HL）作為脂蛋白代謝中的兩個關(guān)鍵酶，在脂代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。此外，載脂蛋白 E（apolipoproteinE，ApoE）作為血漿主要的載脂蛋白之一，與血漿脂蛋白代謝，LDL、CM殘粒進(jìn)入肝細(xì)胞代謝相關(guān)[5]。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransferaseIa，Cpt1a） 是脂肪酸氧化過程中的一種限速酶[6]，它催化長鏈脂酰輔酶A與肉堿合成脂酰肉堿，并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)而被氧化分解，在能量代謝中起重要作用。

已有研究證明，抗氧化劑硫辛酸（LA）能緩解高脂日糧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及血脂代謝紊亂[7-8]，而進(jìn)一步研究LA對血漿脂酶活性及ApoE、Cpt1a mRNA表達(dá)的影響，有助于深入認(rèn)識機(jī)體氧化還原狀態(tài)對脂代謝的調(diào)節(jié)作用，為高脂引發(fā)的血脂紊亂機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

硫辛酸:江蘇常熟富士萊醫(yī)藥化工有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）和丙二醛（MDA），總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C、LDL-C），脂蛋白脂酶（LPL）及肝脂酶（HL）試劑盒:南京建成生物工程研究所；Trizol:Invitrogen公司；熒光染料Evagreen:Biotium公司；冷凍高速離心機(jī):eppendurgh公司；ABI-7000熒光定量 PCR儀。

1.2 動物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

清潔級C57BL／6雄性小鼠40只，預(yù)飼1周后，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組:對照組（正常日糧），高脂組（高脂日糧，含20.0%脂肪），LA組（高脂日糧分別添加0.05%和0.1%LA）。正常日糧和高脂日糧配方見表1。小鼠同室分籠飼養(yǎng)，光暗周期12 h，自由采食和飲水，每周稱一次體重。環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，濕度60%，小鼠飼養(yǎng)6 w后處死。

表1 正常日糧和高脂日糧配方Table 1 Compositions of normal and high fat diet

1.3 血樣及組織樣品采集

小鼠飼喂6周后眼球取血，放入抗凝管測定全血ROS水平，其余離心于（4℃、3 000 r/min離心10 min），取上層血漿于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

斷頸椎處死小鼠后，取肝臟、胰腺、胃、十二指腸、空腸及回腸迅速在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗除去血液，濾紙拭干，精確稱重相同部位組織，加入預(yù)冷的生理鹽水于冰浴下勻漿制得10 g/dL組織勻漿，測ROS水平，其余組織勻漿于-20℃保存?zhèn)溆?。?.1 g肝臟組織迅速加入trizol中，-80℃保存以備RNA提取。

1.4 指標(biāo)的檢測

1.4.1 全血及組織自由基水平的測定 參照luminol化學(xué)發(fā)光法[9-10]測定，使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測，發(fā)光強(qiáng)度表示自由基水平。

1.4.2 血漿和組織勻漿中酶活測定 肝臟中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC），血漿中脂蛋白脂酶（LPL）及肝脂酶（HL）活性及血脂指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.3 肝臟組織ApoE、Cpt1a的RT-PCR檢測 一步法提取肝臟總RNA、反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR:通過NCBI中查出小鼠ApoE、Cpt1a的基因全序列，應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表2。用ABI-7000定量PCR儀，進(jìn)行Real-time RT-PCR擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)體系（25 μL）:10×PCR 緩沖液（含 1.5 mmol/L Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，無菌水 16.5 μL，SYBR green（20×）1.25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94℃變性 3 min，55℃退火1 min，72℃延伸75 s為第一個循環(huán)。94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min為第二個循環(huán)，共30個循環(huán)。終末72℃延伸10 min。檢測各模板的Ct值，通過Ct值進(jìn)行相對定量。

表2 β-actin、Cpt1a和ApoE引物序列Table 2 Sequence of the primers for β-actin、Cpt1a and ApoE （F：Forward；R：Reverse）

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂日糧和LA對小鼠體重的影響

高脂組小鼠體重6w后顯著（P＜0.05）高于正常組。在高脂日糧中添加0.05%LA，與高脂組相比，體重有所下降，但差異不顯著，而添加0.1%LA體重顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表 3。

表3 小鼠體重變化Table 3 Change of body weight

2.2 LA對高脂日糧小鼠全血和各組織氧化還原狀態(tài)的影響

與正常組相比，高脂組小鼠肝臟、胰腺、胃、十二指腸、空腸及回腸ROS水平顯著（P＜0.05）升高，見表4。其中以十二指腸、空腸最為顯著。而添加0.05%LA有降低各組織ROS水平的趨勢，添加0.1%LA則使其自由基顯著降低（P＜0.05），并接近對照組水平。

表4 高脂日糧和LA對小鼠全血及組織自由基的影響Table 4 Effect of LA and high-fat on free radicals in whole blood and tissues of mice （n=8，±s）

表4 高脂日糧和LA對小鼠全血及組織自由基的影響Table 4 Effect of LA and high-fat on free radicals in whole blood and tissues of mice （n=8，±s）

注:不同組之間字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組織 對照組全血(103cd/μL) 0.11±0.03a肝臟(103cd/mg) 5.81±1.30a胃(103cd/mg) 4.02±1.28a胰腺(103cd/mg) 4.20±1.50a十二指腸(103cd/mg) 8.71±2.25a空腸(103cd/mg) 8.04±1.68a回腸(103cd/mg) 4.07±1.99a高脂組0.30±0.09b 9.85±3.22b 6.35±0.62b 8.50±2.10b 20.53±2.65b 12.23±1.17b 8.48±2.29b高脂+0.05%LA 高脂+0.1%LA 0.23±0.05b 0.11±0.05a 7.06±2.80b 4.92±1.80a 5.09±0.81ab 4.15±0.62a 5.90±2.30ab 4.20±2.00a 16.78±1.05b 9.57±2.50a 10.04±0.76b 7.97±1.50a 8.38±1.92b 3.36±1.52a

高脂日糧和LA對小鼠肝臟抗氧化酶活性和總抗氧化能力的影響見表5。與正常組相比，高脂組GSH-Px、CAT 及 T-AOC 顯著下降 （P＜0.05）。 添加0.1%LA，小鼠肝臟抗氧化能力都顯著 （P＜0.05）升高，而添加0.05%LA則效果不顯著。

表5 高脂日糧及LA對小鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響Table 5 Effect of LA on liver antioxidant index of high-fat fed mice（n=8，±s）

表5 高脂日糧及LA對小鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響Table 5 Effect of LA on liver antioxidant index of high-fat fed mice（n=8，±s）

注:不同組之間字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

CAT/（U/mg） 5.30±0.50a GSH-Px/（U/mg） 5.90±0.81a T-AOC/（U/mg） 1.79±0.12a高脂+0.05%LA 高脂+0.1%LA 3.51±0.73b 5.57±0.58a 3.16±0.89b 5.06±0.56a 0.79±0.11b 1.51±0.60a指標(biāo) 對照組 高脂組2.60±0.21b 2.01±0.21b 0.43±0.02b

2.3 LA對高脂日糧小鼠肝臟及血漿MDA含量的影響

高脂日糧攝入可顯著（P＜0.05）提高小鼠血漿及肝臟MDA含量，造成脂質(zhì)過氧化，在高脂日糧基礎(chǔ)上添加0.1%LA可顯著降低小鼠血漿及肝臟中MDA 含量（P＜0.05），而添加 0.05%LA 則效果不顯著，見圖1。

2.4 LA對高脂日糧小鼠血脂的影響

由表6可知，與正常組相比，高脂組小鼠血漿中TCH、TG、LDL-C含量均顯著增高，HDL-C顯著降低（P＜0.05）。添加0.1%LA可顯著改善高脂導(dǎo)致的血脂異常，而0.05%LA的添加量作用不顯著。高脂組動脈粥樣硬化指數(shù)（AI）顯著高于正常組，且高達(dá)正常組的3倍多，而添加0.1%LA則可顯著降低AI值（P＜0.05），添加 0.05%LA 有降低的趨勢但不顯著。

圖1 高脂日糧及LA對小鼠血漿和肝臟MDA含量的影響Fig.1 Effect of LA on live and plasma MDA in high-fat fed mice

表6 LA對高脂日糧小鼠血脂水平的影響Table 6 Effect of LA on plasma lipid in high-fat fed mice（mmol/ml）（n=8，±s）

表6 LA對高脂日糧小鼠血脂水平的影響Table 6 Effect of LA on plasma lipid in high-fat fed mice（mmol/ml）（n=8，±s）

注:不同組之間字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組別 TG對照組 1.28±0.22a高脂組 2.00±0.11b高脂+0.05%LA 1.42±0.29ab高脂＋0.1%LA 1.28±0.36a TCH 2.07±0.45a 3.43±0.19b 2.41±0.31ab 2.33±0.14a LDL-C 0.87±0.07a 1.30±0.16b 1.29±0.04b 0.97±0.07a HDL-C 0.56±0.11a 0.35±0.06b 0.38±0.04b 0.54±0.04a AI 1.35±0.58a 4.80±1.32b 2.77±0.82b 1.63±0.90a

2.5 LA對高脂日糧小鼠血漿LPL、HL活性的影響

高脂組小鼠與正常組相比，血漿肝LPL、HL的活性均顯著降低（P＜0.05），見表 7。添加 0.05%LA 有提高其活性的趨勢，但不顯著；0.1%的添加量作用顯著（P＜0.05），可使其恢復(fù)接近正常組。

表7 LA對高脂日糧小鼠血漿LPL和HL活性的影響Table 7 Effect of LA on plasma LPL、HL in high-fat fed mice（n=8，±s）

表7 LA對高脂日糧小鼠血漿LPL和HL活性的影響Table 7 Effect of LA on plasma LPL、HL in high-fat fed mice（n=8，±s）

組別 HL/(U/mg)對照組 0.83±0.01a高脂組 0.69±0.01b高脂+0.05%LA 0.70±0.04ab高脂+0.1%LA 0.77±0.01a LPL/(U/mg)0.85±0.01a 0.64±0.01b 0.65±0.01b 0.85±0.02a

2.6 LA對高脂日糧小鼠肝臟Cpt1a及ApoE表達(dá)的影響

由圖2可知，與正常組相比，高脂組小鼠肝臟ApoE mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，而Cpt-1a mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。在高脂日糧中添加0.05%LA即可顯著（P＜0.05）下調(diào)ApoE mRNA的表達(dá)，添加量達(dá)到0.1%，可使其表達(dá)量接近于對照組。高脂日糧中添加0.1%LA可顯著（P＜0.05）上調(diào)Cpt1a mRNA表達(dá)量，而添加0.05%LA后上調(diào)作用不顯著。

圖2 高脂日糧及LA對小鼠肝臟ApoE及Cpt1a mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of LA on expression of ApoE （a）and Cpt1a（b） mRNA in liver of mice fed with high-fat diet

3 結(jié)語

氧化損傷與能量代謝之間存在著顯著的相互作用，長期高脂飲食使代謝水平增高，細(xì)胞耗氧增加，ROS過量，過量的活性氧會引起蛋白質(zhì)、脂肪等生物大分子的氧化損傷，損害肝細(xì)胞的完整性從而影響脂質(zhì)代謝[11]，所以氧化應(yīng)激是肥胖、糖尿病等慢性疾病發(fā)生的根源之一[12]。在本研究中，高脂日糧導(dǎo)致小鼠氧化應(yīng)激，各組織自由基水平顯著升高，肝臟CAT、T-AOC和GSH-Px含量較正常組明顯下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA顯著升高，通過降低血漿HL和LPL活性導(dǎo)致脂代謝紊亂，而添加0.1%LA可明顯改善這種脂代謝紊亂，緩解氧化應(yīng)激。LA是脂溶和水溶的兩性分子[13]，這使其能以較高的濃度存在于細(xì)胞內(nèi)外，發(fā)揮清除自由基的作用，同時能與VE和Vc的氧化還原反應(yīng)耦連，使其發(fā)揮抗氧化作用，緩解機(jī)體營養(yǎng)性氧化應(yīng)激。從而降低TG、TCH和LDL，并提高HDL，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，這與國外的研究結(jié)果一致[14]。

線粒體是體內(nèi)產(chǎn)能的主要場所，能量產(chǎn)生主要通過脂肪酸β-氧化和葡萄糖代謝。在脂肪酸β氧化過程中，Cpt1a是其中的一種限速酶，能夠根據(jù)組織的能量需求調(diào)整脂肪酸氧化。生理情況下，Cpt1a表達(dá)受丙二酰輔酶A的抑制，而丙二酰輔酶A的合成又受乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的調(diào)節(jié)；高脂飲食可以通過誘導(dǎo)ACC的活化及增加丙二酰輔酶A的濃度而抑制Cpt1a的表達(dá)[6]。Cpt1a mRNA水平降低將影響脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體進(jìn)行β-氧化實(shí)現(xiàn)能量生成，使已進(jìn)入細(xì)胞的脂肪酸及其活化產(chǎn)物脂酰輔酶A沉積在胞質(zhì)內(nèi)，造成大量脂質(zhì)堆積[15]，從而機(jī)體出現(xiàn)脂代謝紊亂。另一方面，血脂、膽固醇的增加可減少脂肪酸進(jìn)入線粒體，防治自由基的生成。本實(shí)驗(yàn)中，在高脂日糧中添加0.1%LA可顯著降低ROS水平，使小鼠肝臟Cpt1a表達(dá)顯著上調(diào)，增強(qiáng)脂肪酸β氧化，緩解高脂引起的血脂異常。

載脂蛋白E在脂代謝循環(huán)中作為一種血清糖蛋白配體，主要存在于乳糜微粒及其殘體、極低密度脂蛋白、高密度脂蛋白亞群顆粒中，通過與LDL受體及其相關(guān)蛋白、VLDL受體相互作用幫助血漿中脂蛋白脂解與清除，并調(diào)控VLDL和TG的濃度，在膽固醇和脂蛋白代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是脂類代謝和心血管疾病的決定因子[5]。有趣的是，高脂飼喂小鼠肝臟ApoE表達(dá)顯著高于正常組，血漿TG含量顯著升高，而添加10%LA干預(yù)后ApoE表達(dá)量顯著降低。有臨床研究表明血漿TG水平變化有20%到40%與ApoE有關(guān)。在ApoE基因缺陷小鼠的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其肝細(xì)胞分泌的VLDL的TG含量較野生型小鼠顯著減少，如果肝臟ApoE表達(dá)增加，則可使VLDL的TG含量增加。轉(zhuǎn)入ApoE3于ApoE缺陷型小鼠中，使其高水平表達(dá)，可使血漿TG含量比正常高3倍。這可能是由于高水平的ApoE刺激VLDL中TG合成增加及特異地抑制LPL對TG的水解所致[16]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠LPL活性顯著降低。ApoE與血漿膽固醇含量也密切相關(guān)，ApoE參與介導(dǎo)VLDL和CM殘粒的清除。而據(jù)報道，在敲除LDL受體基因小鼠中利用腺病毒使ApoE表達(dá)增加，可使血漿膽固醇水平顯著降低[17]。但也有研究用腺病毒轉(zhuǎn)載ApoE于ApoE敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)即使低水平的ApoE表達(dá)也能使其血膽固醇降低。如果同時敲除ApoE和LDL受體基因，則只有中等水平ApoE表達(dá)才能使膽固醇水平下降[18]。ApoE對脂代謝的影響還有待深入研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了LA對小鼠脂代謝紊亂，氧化應(yīng)激的改善作用，初步推測這種作用可能是通過改善小鼠肝臟Cpt1a和ApoE的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，至于具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[1]Auer J，WeberT，Berent R，et al.Obesity，body fat and coronary atherosclerosis[J].Int J Card，2005，98:227-235.

[2]Weintraub W S.Is atherosclerotic vascular disease related to a high-fat diet?[J].Clin Epid，2002，55:1064-1072.

[3]Grattagliano I，Palmieri V O，Portincasa P，et al.Oxidative stress-induced risk factors associated with the metabolic syndrome:a unifying hypothesis[J].Nutr Bioch，2007:1-14.

[4]Hans Jansen，Belinda Breedveld，Kees Schoonderwoerd.Role of lipoprotein lipases in postprandial lipid metabolism[J].Atherosclerosis，1998，141:31-34.

[5]Philip W，Connelly.The role of hepatic lipase in lipoprotein metabolism[J].Clinica Chimica Acta，1999，286:243-255.

[6]ZANG Yan，WANG Tong，XIE Wei-sheng，et al.Regulation of AcetylCoA carboxylase and carnitine palmitoyl transferase-1 in ratadipocytes[J].Obesity Research，2005，13:1530-1539.

[7]YANG Rui-Li，LE Guo-wei，LI An-lin，et al.Effect of antioxidant capacity on blood lipid metabolism and lipoprotein lipase activity of rats fed a high-fat diet[J].Nutr，2006，22:1185-1191.

[8]Navari-Izzo F，Quartacci M F，Sgherri C.Lipoic acid:a unique antioxidant in the detoxification of activated oxygen species[J].Plant Physiol Biochem，2002，40:463-470.

[9]Esfandiari N.Utility of the nitroblue tetrazolium reduction test for assessment of free radical production by seminal leukocytes and spermatozoa[J].Andrology，2003，24:862-869.

[10]LI Y，ZHU H，Michael A.Detection of mitochondria-derived free radical production by the chemilumigenic probes lucigenin and luminol[J].Biochim Biophys Acta，1999，1428:1-12.

[11]魯軍，任迪鋒.鈍頂螺旋藻的體內(nèi)抗氧化和護(hù)肝作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，28:777-780.LU Jun，REN Di-feng.Antioxidant and hepato-protective effect of Spirulina platensis in vivo[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28:777-780.（in Chinese）

[12]Yorek M A.The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease[J].Free Radic Res，2003，37:471-480.

[13]海春旭.自由基醫(yī)學(xué)[M].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006:321-324.

[14]Butler J A，Hagen T M，Moreau R.Lipoic acid improves hypertriglyceridemia by stimulating triacylglycerol clearance and down regulating liver triacylglycerols ecretion[J].Arch Biochem Biophys，2009，485（1）:632-711.

[15]Ashakumary L，Rouyer I，Takahashi Y，et al.Sesamin，a sesame lignan，is a potent inducer of hepatic fatty acid oxidation in the rat[J].Metabolism，1999，48:1303-1313.

[16]Van E M，Van D K W，Herijgers M，et al.Eseential role for the （hepatic）LDL receptor in macrophage apolipopritein E-induction in serum cholesterol lecels and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2001，154（1）:103-112.

[17]Ichipsuga J，Yonemoto M，Yamada N，et al.Cholesterol lowering in low density lipoprotein receptor knockout mice overexpressing apolipoprotein E[J].Clin Invest，1998，102（2）:386-394.

[18]Van D K W，Bart J M，Van V，et al.In LDL receptor-deficient mice，catabolism of remnant lipoprotein requires a high lebels if apoE but is inhibited by excess apoE[J].J Lipid Res，1999，40:336-344.