彭美芳，陳文學(xué)，李宇真，童惠珠，仇厚援

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

草果（Amomum tsao-ko）為姜科豆蔻屬多年生草本植物，全株具有辛香味，目前主要分布于我國廣西、云南及貴州等地。干燥成熟的草果果實(shí)是日常生活中必備的食用香料，又是我國一種傳統(tǒng)的中藥材，具有溫中、健胃、消食、順氣的功能，常被用于鎮(zhèn)痛、抗胃潰瘍、抗癲癇、抗乙肝病毒，治療寒濕內(nèi)阻及吐瀉等癥[1]。目前，對(duì)草果的研究主要包括揮發(fā)油的提取[2-4]，化學(xué)成分的分析[4]以及草果活性成分的分離[5-6]等方面。有文獻(xiàn)報(bào)道，常規(guī)溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取技術(shù)[2]、超聲波提取法[3]、微波萃取技術(shù)[4]等均已被用于草果揮發(fā)油的提取，由于品種和地區(qū)的差異，經(jīng)GC/MS和毛細(xì)管氣相色譜法的測(cè)定，揮發(fā)油在含量和化學(xué)成分方面不盡相同，但其主成分均為1，8-桉油精。天然存在的草果植物中含有多種生物活性物質(zhì)，具有抑菌[7]、抗氧化[8]等作用。許多植物提取物對(duì)微生物都具有較強(qiáng)的抑制作用，其抗菌作用機(jī)理大致可以分為：降解細(xì)胞壁[9]、破壞細(xì)胞質(zhì)膜[10]、破壞膜蛋白[11]、胞內(nèi)成分滲出、胞質(zhì)凝結(jié)[12]、分子主動(dòng)運(yùn)輸力損耗[13]。大量研究表明草果提取物抑菌效果顯著，對(duì)革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌以及霉菌均具有不同程度的抑菌作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌，抑制效果最佳[5]，但有關(guān)草果的抑菌機(jī)制方面尚無研究。本實(shí)驗(yàn)參考已有的草果抑菌物質(zhì)提取工藝[5]，測(cè)定草果各極性梯度萃取物的最小抑菌濃度（M IC），研究草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，以初步探討草果提取物的抑菌機(jī)理，為草果提取物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果 購自于?？谕淹?；金黃色葡萄球菌 由海南大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等試劑 均屬于分析純，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

FW 177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；WF-300EH型超聲清洗機(jī) 寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；UV-VIS 美國Thermo Fisher Scientific公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率測(cè)定儀 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草果抑菌物質(zhì)的分離萃取[5]草果粉末→浸泡→超聲處理→抽濾→旋蒸→液-液萃取→旋蒸→干燥→樣品。

草果粗提物的提取工藝參數(shù)為：提取溶劑為60%乙醇，料液比1∶16，浸泡時(shí)間20h，超聲波溫度55℃，超聲波時(shí)間45m in。

采用液-液萃取法對(duì)草果粗提物進(jìn)行分離，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇為萃取劑，依次獲得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，以下統(tǒng)稱為草果提取物。

1.2.2 草果提取物M IC的測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取1.2.1得到的草果提取物2g，用10m L丙酮將草果萃取物配制成200mg/m L的草果提取物原液，用試管二倍遞減稀釋法[14]將草果提取物原液稀釋成100、50、25、12.5、6.25mg/m L的樣品液。分別取1m L樣品液與9m L融化培養(yǎng)基混勻，配制成含藥培養(yǎng)基，以金黃色葡萄球菌為供試菌進(jìn)行恒溫倒置培養(yǎng)24h，并同時(shí)做空白對(duì)照，以完全不長菌的最低稀釋濃度為草果提取物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 草果提取物對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響 以M IC為基礎(chǔ)配制含藥液體培養(yǎng)基，設(shè)置空白組和實(shí)驗(yàn)組。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的供試菌液，按5%的接種量加入到含藥培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，每2h取樣，在600nm下測(cè)定OD值，連續(xù)20h。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制出對(duì)應(yīng)的生長曲線。

1.2.4 草果提取物對(duì)菌液蛋白質(zhì)含量的影響

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支10m L具塞試管，按下表1取樣。蓋塞后，將各試管縱向旋轉(zhuǎn)，放置2m in后在595nm波長下測(cè)定OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table1 The preparation of standard curve

1.2.4.2 處理菌液蛋白含量測(cè)定 取經(jīng)6～8h培養(yǎng)的供試菌液，以M IC為標(biāo)準(zhǔn)加入相應(yīng)量的草果提取物，同時(shí)做空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)，每4h取樣，放于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1m L樣品以4000r/m in離心10min，取上清液，用蒸餾水將其稀釋5倍。取3支10m L具塞試管，每管加入處理菌液0.1m L，再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合，2m in后在595nm波長下測(cè)定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行倍數(shù)換算。

1.2.5 草果提取物對(duì)菌體電導(dǎo)率的影響 按1.2.3的方法在菌液培養(yǎng)至2、6、10、14、18h時(shí)分別取樣，4000r/m in離心10m in，取上清液稀釋20倍，用DDS-307型電導(dǎo)儀測(cè)定其電導(dǎo)率。電導(dǎo)率變化率的公式如下：

式中，R：電導(dǎo)率變化率；Rs：實(shí)驗(yàn)組電導(dǎo)率；Rc：對(duì)照組電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果提取物最小抑菌濃度（M IC）

表2 草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table2 The MIC of Amomum tsao-ko extract on Staphylococcus aureus

草果乙酸乙酯和氯仿提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的M IC最低，為1.25mg/m L；其次是石油醚萃取物，為2.5mg/m L；正丁醇萃取物為5mg/m L，MIC最高。

2.2 草果提取物對(duì)菌體生長曲線的影響

圖1 金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Staphylococcus aureus

由圖1可以看出，金黃色葡萄球菌空白組經(jīng)過短暫的延滯期后迅速進(jìn)入快速生長的對(duì)數(shù)期，OD值顯著增高，石油醚、氯仿和正丁醇萃取物實(shí)驗(yàn)組OD值稍有增長，幅度較小，而乙酸乙酯萃取物實(shí)驗(yàn)組OD值幾乎無增長，與空白組差異顯著，表明乙酸乙酯萃取物抑菌效果最佳。同時(shí)可以得出，草果提取物的抑菌作用主要表現(xiàn)在生長對(duì)數(shù)期，通過抑制細(xì)菌的分裂速度，縮短或延緩其對(duì)數(shù)期，從而有效控制菌體數(shù)量的增加[15]。

2.3 草果提取物對(duì)處理菌液蛋白質(zhì)含量的影響

圖2 蛋白質(zhì)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Protein-absorbance standard curve

圖3 草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌菌液蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of Amomum tsao-ko extracton bacterium protein content of Staphylococcus aureus

從標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）查得相應(yīng)樣品的蛋白含量見圖3。金黃色葡萄球菌空白組菌液蛋白質(zhì)含量隨著時(shí)間的延長而降低，石油醚、氯仿和正丁醇萃取物組菌液蛋白質(zhì)含量在前4h有小幅度降低，之后則呈逐漸上升趨勢(shì)，而乙酸乙酯萃取物組則直接呈上升趨勢(shì)。分析原因可能為，草果提取物抑制菌體數(shù)量的增長，從而導(dǎo)致菌液蛋白質(zhì)消耗量降低，另外草果提取物可能使菌體細(xì)胞膜破裂，有胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量增大[16]。

2.4 草果提取物對(duì)菌液電導(dǎo)率的影響

由圖4得出，隨著抑菌物質(zhì)作用時(shí)間的延長，菌液電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)。其中乙酸乙酯萃取物對(duì)菌液電導(dǎo)率影響最大，接著依次為氯仿萃取物，石油醚萃取物，最后為正丁醇萃取物。菌液電導(dǎo)率的改變，可以反映細(xì)胞膜滲透性的變化，加入草果提取物，菌液的電導(dǎo)率增加，表明草果提取物可使菌體細(xì)胞膜的通透性增加，使菌體細(xì)胞質(zhì)滲漏到了細(xì)胞外[17]。分析原因可能是草果提取物誘導(dǎo)產(chǎn)生了某些降解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶所致[18]。

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的M IC，并以M IC為基礎(chǔ)，研究了草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長曲線，菌液蛋白質(zhì)含量和電導(dǎo)率變化的影響。結(jié)果表明，草果抑菌物質(zhì)主要影響金黃色葡萄球菌生長曲線的對(duì)數(shù)生長期，有效抑制細(xì)菌的增長，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，氯仿和石油醚萃取物次之，正丁醇萃取物最差。通過對(duì)菌液蛋白質(zhì)含量和電導(dǎo)率變化的測(cè)定，推測(cè)其抑菌機(jī)理可能是草果提取物誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生降解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶，提高了膜的通透性，致使胞內(nèi)物質(zhì)外泄[19]，菌體不能正常生長繁殖，從而達(dá)到抑菌作用。

圖4 草果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌菌液電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effectof Amomum tsao-ko extracton bacterium conductivity of Staphylococcus aureus

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