小麥面筋蛋白酶解制備合適分子量小肽的研究

谷中華，朱 旭，楊凌霄，程李琳，王 立，張 暉，錢海峰

（江南大學食品學院與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

小麥面筋蛋白主要是由麥谷蛋白、麥醇蛋白、麥球蛋白以及麥清蛋白組成，其中麥谷蛋白和麥醇蛋白是面筋蛋白的主要成分（占85%左右），面筋蛋白富含谷氨酰胺和脯氨酸，由鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵維持其結(jié)構(gòu)，等電點偏中性。傳統(tǒng)的營養(yǎng)學理論認為，機體對蛋白質(zhì)的消化吸收和利用是以氨基酸的形式進行，但消化生理實驗證明機體對蛋白質(zhì)的利用更多的是以小肽的形式進行利用。小肽是由α-氨基酸以肽鍵的形式相互連接而成的鏈狀化合物，是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，按照小肽中氨基酸個數(shù)的不同，小肽可分為二肽、三肽、四肽等，分子量一般分布在1000u以內(nèi)[1-2]。楊得勝等[3]利用胰蛋白酶和胃蛋白酶組合酶解面筋蛋白高效制備出谷氨酰胺小肽；孔祥珍等[4]利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶對小麥面筋蛋白進行酶解，制備的小肽具有生物鎮(zhèn)痛活性，且相對分子量在2000u以下；張亞飛等[5]利用堿性蛋白酶酶解面筋蛋白，所得的小麥肽混合物經(jīng)樹脂分離獲得四種小肽成分，可以刺激小鼠脾細胞增值。

在傳統(tǒng)利用蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的工藝中，往往只是利用水解度作為酶解控制的指標，而對于水解過程中蛋白酶的選擇，酶解物中多肽含量及其分子量分布等指標考察的文獻報道較少。根據(jù)已有的文獻報道，堿性蛋白酶和中性蛋白酶在酶解面筋蛋白上的應用較多，而對胃蛋白酶和胰蛋白在其應用上的文獻報道較少，而這四種蛋白酶都是目前工業(yè)化酶解蛋白中常見的商品化蛋白酶。因此本實驗利用這四種蛋白酶對小麥面筋蛋白進行酶解，通過分析酶解物中蛋白質(zhì)水解度與多肽含量之間的關(guān)系、多肽分子量分布、以及酶解物的氨基酸組成，探究不同的蛋白酶對小麥面筋蛋白酶解的影響，同時結(jié)合動物實驗，探究酶解物的功能特性，為工業(yè)化酶解小麥面筋蛋白生產(chǎn)分子量分布合適的小肽產(chǎn)品提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白（蛋白含量為75%） 常州聯(lián)海生物科技有限公司；中性蛋白酶（Neutrase，9.62×105U/g）、堿性蛋白酶（4.3×105U/g） 北京諾維信有限公司；胃蛋白酶（pepsin，6.74×105U/g） SIGMA北京有限公司；胰蛋白酶（pancreas，4.0×105U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；ICR小鼠（雄性，體重（20±2）g） 上海斯萊克實驗動物有限公司；IgG、IgM試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；其他所用試劑 均為分析純。

Waters600高效液相色譜儀 美國沃特斯公司；IKAMAG加熱磁力攪拌器 廣州儀科實驗技術(shù)有限公司；HITACHI高速冷凍離心機日本日立公司；FORMA702超低溫冰箱 THERMO公司；Free Zone2.5冷凍干燥機 美國Laboconcor公司；HZ-9212SB水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉實驗儀器廠；H 835-50型氨基酸自動分析儀 Aglient公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 各種蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的最適條件通過對小麥面筋蛋白的酶解實驗，并參考前期錢海峰等[6-7]對小麥面筋蛋白酶解物的制備及其功能性質(zhì)的研究，得出各種蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的最適溫度和最適pH，其中堿性蛋白酶的最適溫度為50℃、最適pH為8.5，中性蛋白酶的最適溫度為52℃、最適pH為6.5，胃蛋白酶的最適溫度為37℃、最適pH為1.5，胰蛋白酶的最適溫度為37℃、最適pH為8.5。在制備各自的酶解物時，堿性蛋白酶的加酶量為E/S= 1∶250，酶解時間3h，中性蛋白酶的加酶量為E/S= 1∶200，酶解時間4h，胃蛋白酶的加酶量為E/S=1∶250，酶解時間3h，胰蛋白酶的加酶量為E/S=1∶200，酶解時間3.5h。

1.2.2 小麥面筋蛋白的酶解方法 小麥面筋蛋白（WG）按1∶10（m/v）比例溶于水中，均質(zhì)過后形成一定濃度的懸浮液，調(diào)節(jié)到合適的pH和溫度后，加入一定量的酶，在恒溫磁力攪拌器上進行酶解反應，待酶解反應結(jié)束后，在沸水浴中滅酶10min，分別制得胃蛋白酶的酶解物（PeWGH）、胰蛋白酶的酶解物（PaWGH）、中性蛋白酶的酶解物（NWGH）、堿性蛋白酶的酶解物（AWGH）。當上述酶解物溶液的溫度冷卻到室溫條件下，用冷凍離心機離心（6000r/min，15m in，4℃），收集上清液，一部分用于測水解度和多肽含量，另一部分冷凍凍干后用于測定多肽的分子量分布和氨基酸含量。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白質(zhì)水解度的測定 蛋白質(zhì)的水解度是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被斷裂的程度。

本實驗在中性和堿性條件下采用pH-Stat法、在酸性條件下采用三氯乙酸（TCA）法測定蛋白質(zhì)水解度，見參考文獻[8-9]。

1.3.2 多肽含量的測定方法 采用雙縮脲法測定多肽的含量，對參考文獻[10]作進一步改進。取酶解物上清液2m L，加入2m L的10%三氯乙酸溶液，均質(zhì)后冷凍離心（6000r/m in，20m in，4℃），再取離心后的上清液2m L和3m L的雙縮脲試劑混合均勻，在540nm波長條件下測量OD值，利用標準曲線（y=0.1075x-0.0189），得出樣品上清液的多肽含量，計算公式見式（1）。

式中：A為OD值；N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.3 多肽分子量分布的測定 采用高效凝膠過濾色譜法，見QB/T 2653-2004[11]。

色譜條件：色譜柱：TSKgel G2000SWXL；柱溫：30℃；流動相：乙腈/水/三氟乙酸，10∶90∶0.1（體積比）；流速：0.5m L/m in；進樣量：10μL；檢測波長：UV220nm。

1.3.4 多肽樣品中氨基酸含量的測定 測量方法：稱樣：根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的含量，稱取適量的樣品放入水解管中；水解：水解管中加入8m L的6mol/L的HCl，邊抽真空邊封管，封好后的水解管在110℃的烘箱中水解22h；定容：水解完畢后，將水解管中的溶液移出，用超純水定容至25m L，然后用兩層濾紙過濾，取濾液1m L移至25m L的燒杯，放入真空干燥器中抽真空30m in后，干燥過夜；蒸酸、取樣：取出已蒸干的小燒杯，加入1m L的0.02mol/L的HCl，靜置一段時間，然后用玻璃棒攪拌直接導入1.5m L的離心管內(nèi)，10000r/m in離心10m in，取500μL至H 835-50氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成分析。

1.4 小麥面筋蛋白酶解物的功能性動物實驗

取健康小鼠80只，適應性喂養(yǎng)一周后，隨即分為六組，每組15只：正常對照組BG、面筋蛋白添加組WG、胃蛋白酶酶解物添加組PeWGH、胰蛋白酶酶解物添加組PaWGH、堿性蛋白酶酶解物添加組AWGH、中性蛋白酶酶解物添加組NWGH，后五組添加物的添加量都為5%，后四組添加的酶解物的蛋白質(zhì)水解度為12%。

動物實驗中各個實驗指標的測量公式見式（2）、式（3）。

吞噬細胞吞噬率的測定方法見參考文獻[12]。

IgG、IgM的測量方法嚴格按照說明書的要求進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的酶解物中蛋白質(zhì)水解度和多肽含量的關(guān)系

分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶對小麥面筋蛋白進行酶解，測量在不同的蛋白質(zhì)水解度時酶解物中的多肽含量，結(jié)果見圖1。

圖1 四種蛋白酶酶解物的水解度與多肽含量的關(guān)系Fig.1 The relationship of four kinds of protease enzymatic hydrolysis between degree of hydrolysis and peptide content

從圖1各種蛋白酶酶解物的曲線走勢中可知，蛋白質(zhì)水解度在15%范圍內(nèi)，四種蛋白酶酶解物中多肽含量隨著蛋白質(zhì)水解度的提高增加的速率較大，而蛋白質(zhì)水解度超過15%以后，多肽含量的增加速率較為平緩，蛋白質(zhì)水解度再進一步增加時，多肽含量呈現(xiàn)出下降的趨勢。

因為蛋白質(zhì)水解度較低時，酶的作用位點不飽和，蛋白酶酶解小麥面筋蛋白不充分，因此蛋白酶能快速地斷裂面筋蛋白中的肽鍵，使其裂解為分子量較大的蛋白質(zhì)和多肽，根據(jù)谷中華等[13-14]前期的實驗結(jié)果也證實利用中性蛋白酶酶解小麥面筋蛋白時，在最初的60min內(nèi)，蛋白質(zhì)水解度增加的速率最快，這也與在低水解度條件下多肽含量增加速率較快相吻合；隨著蛋白質(zhì)水解度的提高，酶的作用位點不斷地與蛋白酶結(jié)合，當?shù)鞍踪|(zhì)水解度達到一定范圍后，面筋蛋白上酶的結(jié)合位點可能已經(jīng)趨于飽和，面筋蛋白被酶解的程度已經(jīng)趨于最大，此時面筋蛋白的水解速率達到最大，多余的蛋白酶可能不會再與面筋蛋白結(jié)合，但會與小分子量的蛋白質(zhì)、多肽進一步反應，從而使得多肽含量進一步增加；當?shù)鞍踪|(zhì)的水解度再增加，此時酶解物中可能含有對蛋白酶具有抑制作用的成分，蛋白質(zhì)水解度的增加速率變得緩慢，并且伴隨著蛋白酶與多肽不斷的結(jié)合，會使得多肽被裂解為小肽和氨基酸，會使得多肽含量逐漸降低。

從圖1中還可以看出，在水解度基本保持一致時，胃蛋白酶酶解物中的多肽含量明顯高于其他三組，其次是堿性蛋白酶處理組，胰蛋白酶和中性蛋白酶處理組中多肽含量最低。

在酶解過程中，胃蛋白酶、堿性蛋白酶處理組需要添加大量的酸堿調(diào)節(jié)劑使得酶解溶液的酸堿度適應蛋白酶的最適酶解條件，因此在這兩種蛋白酶處理組中，面筋蛋白本身會有一部分溶解在反應溶液中，蛋白酶與底物的作用面積很大，使得酶解效果更明顯；胰蛋白酶處理組只添加少量的堿性調(diào)節(jié)劑，而中性蛋白酶處理組不需要添加酸堿調(diào)節(jié)劑，因此在酶活力和加酶量基本一致的情況下，胰蛋白酶處理組中的多肽含量比中性蛋白酶處理組要高，但比前兩蛋白酶處理組要低。

2.2 不同蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的酶解物中多肽分子量分布

不同的蛋白酶即使對相同的底物，酶解效果也會有很大的差異。為了探究這四種蛋白酶對小麥面筋蛋白進行酶解時酶解物中多肽分子量分布之間的差異，在蛋白質(zhì)水解度為12%時，分別測量四種酶解物中多肽的分子量分布，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，與沒有酶解的小麥面筋蛋白相比，四種蛋白酶的酶解物中多肽的分子量分布總體偏小，說明酶解效果明顯；而四種蛋白酶的酶解物在蛋白質(zhì)水解度為12%左右時，堿性蛋白酶酶解物中小分子量肽（＜1000u）占80%左右，其次是胰蛋白酶的酶解物，占65%左右，而胃蛋白酶酶解物和中性蛋白酶酶解物中小分子量肽占30%左右。

表1 四種蛋白酶酶解物中多肽的分子量分布Table1 The four kinds of protease hydrolysates polypeptide inmolecularweight distribution

四種蛋白酶的酶解物中多肽分子量分布之所以有較大的差別，推測是由于本實驗所用的堿性蛋白酶、中性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶，而胰蛋白酶的作用位點在賴氨酸和精氨酸之間，蛋白酶作用位點的不同，會使得蛋白酶在酶解小麥面筋蛋白的過程中，肽鍵斷裂的程度和方式存在差異，從而對多肽的肽鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進而使得多肽的分子量分布有所不同。

2.3 不同蛋白酶酶解物的功能特性研究

在蛋白質(zhì)水解度為12%時，將四種蛋白酶的酶解物添加到實驗動物小鼠的基礎飼料中，探究其多肽分子量分布與酶解物的功能性關(guān)系，數(shù)據(jù)采用Spss軟件進行分析，數(shù)值以Mean±SD表示，實驗結(jié)果見表2。

實驗結(jié)果表明，添加AWGH、PaWGH酶解物的實驗組與NWGH、PeWGH相比小鼠的平均采食量明顯偏高，且差異性極顯著（p＜0.01），小鼠的粗蛋白消化率也偏大，但差異性不明顯；在免疫性方面，添加AWGH和PaWGH酶解物的實驗組與NWGH和PeWGH相比小鼠的IgG含量明顯偏高，且差異性極顯著（p＜0.01），吞噬細胞的吞噬率和IgM的含量也偏大，但是差異性不明顯。上述四種酶的酶解物添加組與基礎組BG相比，在消化率和免疫特性方面都具有顯著性的差異。

有文獻報道[15-16]，多肽酶解物苦味的大小與肽分子量大小顯著相關(guān)，當分子量為1000～4000u時具有苦味，而小于1000u的小肽幾乎沒有苦味，因此添加AWGH和PaWGH實驗組的小鼠平均采食量較高；機體對于小肽的吸收是區(qū)別于氨基酸的，是一種相對獨立的轉(zhuǎn)運吸收方式，且小肽吸收機制不易飽和，轉(zhuǎn)運速度快，小肽的比例越高，吸收就越迅速，上面的實驗數(shù)據(jù)也表明添加AWGH和PaWGH的實驗組小鼠粗蛋白的消化率較高。Cornell HJ[17]研究，小肽對免疫系統(tǒng)具有多方面的調(diào)節(jié)作用，既可有效提高非特異性免疫功能，增強巨噬細胞的吞噬能力，也可以對特異性免疫功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，本實驗結(jié)果說明，使用適量的小肽可以提高實驗動物血清的免疫球蛋白含量，能夠誘導某些免疫功能的活化，增強免疫效果，添加AWGH和PaWGH對實驗動物的消化和免疫機能有明顯促進作用。

所以酶解小麥面筋蛋白的四種蛋白酶中，堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解小麥面筋蛋白制備小分子量肽酶解物存在著天然的優(yōu)勢，但是在制備酶解物的過程中，堿性蛋白酶要加大量的酸堿調(diào)節(jié)劑，會為后續(xù)產(chǎn)品的脫鹽帶來很大的技術(shù)難題。

2.4 不同蛋白酶處理小麥面筋蛋白的酶解物中氨基酸含量差異

為了進一步探究四種蛋白酶對小麥面筋蛋白酶解作用的差異，以及酶解過程中小麥面筋蛋白是否被裂解為氨基酸，以及斷裂的程度，對上述四種酶解物中總氨基酸含量和游離氨基酸含量分別進行測定，結(jié)果見表3。

實驗結(jié)果顯示，四種蛋白酶在酶解小麥面筋蛋白時，蛋白質(zhì)水解度在12%時，上清液中谷氨酸、脯氨酸含量都較高，這是因為面筋蛋白中的麥谷蛋白富含谷氨酸，麥醇溶蛋白富含脯氨酸。

四種蛋白酶的酶解物與沒有酶解的小麥面筋蛋白相比，總氨基酸含量都明顯增加，但是游離氨基酸含量沒有明顯變化，說明蛋白質(zhì)水解度在12%時，酶解面筋蛋白生成的游離氨基酸含量較少，蛋白酶對底物的酶解程度適中，沒有過度水解。在總氨基酸含量上，四種蛋白酶的酶解物與沒有酶解的小麥面筋蛋白相比，必需氨基酸含量基本保持不變，而非必需氨基酸的含量有明顯的提高，且非必需氨基酸含量明顯高于必需氨基酸含量；而在游離氨基酸含量方面，四種蛋白酶的酶解物與沒有酶解的小麥面筋蛋白相比，必需氨基酸含量有所增加，且必需氨基酸含量和非必需氨基酸含量差異不大，說明通過蛋白酶的酶解作用主要增加的是非必需氨基酸的含量。

3 結(jié)論

3.1 四種蛋白酶在酶解小麥面筋蛋白制備小分子量肽酶解物時，在多肽含量、小肽的分子量分布、氨基酸含量上與沒有酶解的對照組相比，均有大幅度的提高，說明蛋白酶酶解效果顯著。在蛋白質(zhì)水解度保持一致時，胃蛋白酶處理組中多肽含量最高，其次是堿性蛋白酶處理組，然后是胰蛋白酶和中性蛋白酶處理組。

3.2 在小肽得率上，堿性蛋白酶的酶解效果最明顯，在蛋白質(zhì)水解度為12%左右時，小肽的得率超過80%，其次是胰蛋白酶，小肽的得率達到65%左右，然后是中性蛋白酶和胃蛋白酶，小肽得率在30%左右。

3.3 動物實驗結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)水解度為12%時，堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解物可以顯著的增加實驗動物的消化和免疫功能，與中性蛋白酶和胃蛋白酶處理組相比在平均采食量和IgG的含量上具有顯著性的差異，在粗蛋白消化率和IgM含量以及吞噬細胞的吞噬率方面也有提高作用。

表2 不同蛋白酶的多肽酶解物對實驗動物的影響Table2 Effectofwheatgluten hydrolysateswith four kinds of protease on functionality in

3.4 在蛋白質(zhì)水解度為12%時，四種蛋白酶的酶解物中總氨基酸和游離氨基酸含量與沒有酶解的原料相比均有提高，但游離氨基酸含量差異不大，說明四種蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的酶解程度適中，沒有過度水解；四種蛋白酶的酶解物中非必需氨基酸含量與沒有酶解的原料相比均有提高，但必需氨基酸含量差異不大，說明蛋白酶的酶解作用主要是增加非必需氨基酸的含量。

表3 四種蛋白酶酶解物中氨基酸含量的差異Table3 The amino acid contentof change in four kinds of protease

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