韓克強，李 靖，梁 平，鄭 璐，黃小兵 (第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院肝膽外科，重慶400037)

既往研究提示，骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是肝臟損傷時參與調(diào)控肝修復(fù)重建的關(guān)鍵因素之一，在肝臟部分切除術(shù)后再生，肝纖維化后修復(fù)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［1］。而龜板是中醫(yī)治療肝損傷的各種方劑重要組成部分，中醫(yī)臨床實踐已經(jīng)證實其對促進肝臟再生、修復(fù)均有較好的療效，但是對于其治療機制一直不夠清楚［2］。本研究通過動物在體研究了龜板飼養(yǎng)對MSCs 肝臟歸巢的影響，旨在為促進肝臟部分切除術(shù)后再生、急慢性肝損傷修復(fù)的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)培養(yǎng)、標記及移植

按張剛慶等［3］方法，脫頸法處死雄性SD 大鼠，取雙后肢股骨，DHanks液吹吸骨髓，DMEM-L培養(yǎng)基稀釋。密度梯度離心法收集單個核細胞，PBS 洗 2 次后接種于 24 孔板內(nèi)，以DMEM-L(含10%FBS)培養(yǎng)基，在5%CO2，37 ℃飽和濕度下培養(yǎng)，待細胞生長至瓶底90%融合時，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，按1 ×104cm-3傳代培養(yǎng)，收集第 3 ～4 代 MSCs 用于后續(xù)實驗。分別以攜帶大鼠c-met siRNA 的腺病毒Ad-si/c-met 及空腺病毒載體vector(均由江蘇省分子醫(yī)學生物技術(shù)重點實驗室惠贈)轉(zhuǎn)染MSCs，腺病毒均攜帶綠色熒光蛋白GFP，擴增培養(yǎng)后消化、收集，生理鹽水重懸后制成單細胞懸液。按移植細胞不同，分為Ad-si/c-met MSCs 移植組、空病毒對照移植組及假手術(shù)組，Ad-si/c-met MSCs 移植組取轉(zhuǎn)染了 Ad-si/c-met 的 MSCs 懸液1 mL(含細胞數(shù)約1.0 ×106)，經(jīng)大鼠尾靜脈注射移植，以同樣方式注入等量轉(zhuǎn)染了vector 的MSCs 作為空病毒對照移植組，以同樣方式注入生理鹽水作為假手術(shù)對照。單純移植MSCs 時，均以攜帶GFP 蛋白的腺病毒轉(zhuǎn)染作為移植細胞標記。移植MSCs 均2 d 注射1 次，1 周后處死動物觀察相關(guān)指標。

1.2 實驗動物準備及分組

6 ～8 周齡雄性 SD 大鼠(體質(zhì)量 200 ～250 g)購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。采用水煎法制備含龜板生藥量1 kg/L的水煎液，根據(jù)成人日服藥量10倍折算成大鼠灌胃劑量，4g/kg，灌前稀釋成4 mL。根據(jù)是否服用龜板水煎液分為龜板組和普食組，2 組均常規(guī)飼養(yǎng)，龜板組每天給予龜板口服液4 mL，分上午、下午2 次灌胃1 周;普食組則給予等體積蒸餾水灌胃。

1.3 Western blot 檢測 HGF、c-met 蛋白

組織總蛋白提取:脫頸處死動物，取各組肝臟組織100 mg。加入1 mL 冰預(yù)冷的蛋白提取液和10 μl PMSF，然后在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。將樣品轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管中，4 ℃，20 000 r/min 離心15 min，收集上清。細胞總蛋白提取:4 ℃預(yù)冷的PBS 洗細胞3 次，加入預(yù)制的含 PMSF 裂解液，冰上裂解30 min，裂解后，用干凈的刮棒將細胞碎片和裂解液移至離心管中。4 ℃，16 000 r/min 離心20 min，收集上清。取其中少量測蛋白濃度(BCA 法)，其余分裝凍存。取等量預(yù)處理的蛋白樣品上樣，恒壓60 V 進行 SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5%脫脂奶粉-PBST 室溫封閉1 h 后，加入羊抗大鼠 HGF 抗體(1︰1 000)、羊抗大鼠 c-met 抗體(1︰1 500)、羊抗大鼠 GAPDH(1︰1 000)、4 ℃孵育過夜，再與 HRP 標記的兔抗羊 IgG 37 ℃孵育1 h，按ECL 發(fā)光試劑盒說明書操作，凝膠成像儀(美國Bio-Rad 公司)曝光、照相。目的蛋白量以GAPDH 相對量表示。

1.4 激光共聚焦檢測肝臟MSCs 含量

取肝臟組織，做冰凍切片，4%多聚甲醛固定后PBS 洗滌3次，封片。移植MSCs 中均表達GFP，直接激光共聚焦顯微鏡下觀察MSCs 分布(綠色熒光細胞)情況，每張切片隨機選10 個視野，計數(shù)MSCs 的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標準差(±s)進行描述。2 組間比較使用t 檢驗，3 組間比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 龜板水煎液飼養(yǎng)對移植MSCs 肝臟歸巢的影響

激光共聚焦法檢測定植于肝臟組織MSCs 數(shù)量。根據(jù)是否使用龜板水煎液飼養(yǎng)及是否移植MSCs，分為龜板移植組，普食移植組，龜板假手術(shù)組，普食假手術(shù)組。每個視野下MSCs 平均數(shù):龜板移植組(22.62 ±2.03)較普食移植組(15.34 ±1.87)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。龜板假手術(shù)組及普食假手術(shù)組均未檢測到移植MSCs。

2.2 龜板水煎液飼養(yǎng)對大鼠肝臟HGF 蛋白表達的影響

Western blot 檢測龜板移植組、普食移植組、龜板假手術(shù)組、普食假手術(shù)組肝臟組織HGF 蛋白水平，分別為:龜板移植組(0.64 ± 0.04)，普食移植組(0.41 ± 0.03)，龜板假手術(shù)組(0.60 ±0.05)，普食假手術(shù)組(0.36 ±0.02)。在正常大鼠及受體大鼠中，龜板水煎液飼養(yǎng)均明顯增加肝臟HGF蛋白水平(圖1)。

圖1 Western blot 檢測肝臟組織HGF 蛋白水平

2.3 阻斷HGF/c-met 對MSCs 肝臟歸巢的影響

使用HGF 受體c-met 的siRNA 腺病毒轉(zhuǎn)染移植MSCs，Adsi/c-met 轉(zhuǎn)染組 c-met 蛋白水平(0.12 ±0.01)明顯低于空病毒轉(zhuǎn)染組(0.52 ±0.04)及未轉(zhuǎn)染組(0.54 ±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。同時，各組肝臟組織每個視野下MSCs 平均數(shù):龜板 Ad-si/c-met 轉(zhuǎn)染組(14.84 ± 1.84)，龜板空病毒轉(zhuǎn)染組(21.89 ±1.95)，龜板未轉(zhuǎn)染組(22.51 ± 2.67)。提示 Ad-si/c-met 轉(zhuǎn)染MSCs 可明顯減少龜板水煎液飼養(yǎng)誘導的移植MSCs肝臟歸巢。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，龜板水煎液飼養(yǎng)與普通飲食相比，可促進靜脈移植的MSCs 向肝臟定植，即增加MSCs 的肝臟歸巢。龜板是龜科動物烏龜?shù)母辜?，既往研究發(fā)現(xiàn)龜板的醋酸乙酯部位分離出來的成分含有地塞米松類似的甾類成分，甾類化合物主要是甾醇脂和甾酮類。具有促進干細胞增殖、遷移等多種作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)，給予龜板口服液后能促進循環(huán)中的MSCs 在損傷脊髓內(nèi)存活和增殖，減輕脊髓損傷和腦缺血后神經(jīng)損傷和病理改變，并增強神經(jīng)干細胞增殖。龜板亦能增強MSCs 移植后分化為神經(jīng)元。在腦缺血的大鼠給予移植MSCs 并給予龜板口服液，和沒有給予龜板口服液的大鼠比較能明顯促進MSCs 在缺血腦紋狀體內(nèi)存活和增殖，且能增強MSC 移植后分化為神經(jīng)元［4］。這些發(fā)現(xiàn)均證實，龜板可以影響干細胞的增殖分化并進而參與器官的損傷和修復(fù)。除增殖分化能力外，組織特異性的歸巢是影響干細胞移植治療效果的另一重要因素，本研究的發(fā)現(xiàn)為尋找促進MSCs 肝臟歸巢提供了新的思路。

龜板的化學成分復(fù)雜，同時MSCs 趨化、遷移的影響因素眾多，因此闡明龜板促MSCs 肝臟歸巢的機制相對復(fù)雜［5-6］。但近來研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞生長因子及其唯一受體c-met 在介導干細胞優(yōu)勢分布中扮演重要角色［7］。本研究通過檢測肝臟組織局部HGF 水平發(fā)現(xiàn)，龜板飼養(yǎng)可增加肝臟組織的HGF 含量，推測HGF 表達增高可能與MSCs 肝臟歸巢增多關(guān)系密切。通過基因沉默技術(shù)低表達移植 MSCs 的 c-met，部分阻斷HGF/c-met 軸后，發(fā)現(xiàn)c-met 低表達可明顯減弱龜板飼養(yǎng)誘導的MSCs 肝臟歸巢。HGF 是間質(zhì)細胞衍生的一種促進細胞有絲分裂多功能因子，具有較強的抗凋亡、抗纖維化，促進血管再生，調(diào)節(jié)細胞生長和運動，促進多種細胞組織形態(tài)的發(fā)生的作用，在組織形成、損傷修復(fù)中起著重要的作用。HGF 配體為c-met，已經(jīng)證實 MSCs 表達 c-met［8］。HGF 和 c-met 二者結(jié)合后有三條主要的信號途徑，分別是PI3K/Akt、P38MAPK 和ERK，且在干細胞內(nèi)均可表達和活化［9］。Kucia 等［10］發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷的小鼠模型中，HGF 誘導骨髓干細胞向損傷的神經(jīng)組織分布并促進神經(jīng)組織再生，將骨髓干細胞用抗c-met 抗體預(yù)處理后，可減少骨髓干細胞向損傷的神經(jīng)組織分布。Trapp 等［11］研究也同樣發(fā)現(xiàn)，HGF/c-met 能夠介導擴增的骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷組織的優(yōu)勢分布。提示HGF/c-met 軸能夠介導干細胞的靶向分布。

綜上所述，我們的研究提示龜板治療可能通過HGF/c-met 軸介導MSCs 優(yōu)勢分布于肝臟組織。但龜板水煎液成分復(fù)雜，對其有效成分的探討，及其在細胞模型中的作用還有待下一步細胞實驗研究。

［1］Hwang S，Hong HN，Kim HS，et al.Hepatogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a rat model of thioacetamide-induced liver cirrhosis［J］.Cell Biol Int，2012，36(3):279 -288.

［2］Chen DF，Zeng HP，Du SH，et al.Extracts from Plastrum testudinis promote proliferation of rat bone-marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Cell Prolif，2007 40(2):196 -212.

［3］張剛慶，方馳華，池達智，等.共同培養(yǎng)誘導骨髓基質(zhì)干細胞向肝細胞分化的研究［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(9):648 -651.

［4］杜少輝，陳東風，李伊為，等.龜板對腦缺血大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植后轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響［J］.中華醫(yī)學雜志，2005，85(3):205 -207.

［5］李熙燦，謝學明，黃春花，等.龜板醇提物對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞氧化損傷的修復(fù)及其抗脂質(zhì)過氧化作用［J］.中草藥，2007，38(7):1043 -1046.

［6］朱志立，米 娜，李 靖，等.趨化因子受體CXCR4 在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達［J］.局解手術(shù)學雜志，2010，19(6):462 -464.

［7］Kanemura H，Iimuro Y，Takeuchi M，et al.Hepatocyte growth factor gene transfer with naked plasmid DNA ameliorates dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats［J］.Hepatol Res，2008，38(9):930 -939.

［8］Liu X，Shen W，Yang Y，et al.Therapeutic implications of mesenchymal stem cells transfected with hepatocyte growth factor transplanted in rat kidney with unilateral ureteral obstruction［J］.J Pediatr Surg，2011，46(3):537 -545.

［9］Hua ZY，Song J，Cheng F，et al.The effect of hepatocyte growth factor on the initiation phase of liver regeneration after cold ischemia in a rat model of small-for-size liver transplantation ［J］.Hepatogastroenterology，2012，59(117):1548 -1552.

［10］Kucia M，Zhang YP，Reca R，et al.Cells enriched in markers of neural tissue-committed stem cells reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood following stroke［J］.Leukemia，2006，20(1):18 -28.

［11］Trapp T，Kogler G，El-Khattouti A，et al.Hepatocyte growth factor/c-MET axis-mediated tropism of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells for neuronal injury［J］.J Biol Chem，2008，283(47):32244 -32253.