毛秀海 杜建聰 黃 慶 樊春海 鄧素輝

（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所嘉定園區(qū) 上海 201800）

超分辨光學(xué)顯微鏡的生物學(xué)應(yīng)用

毛秀海 杜建聰 黃 慶 樊春海 鄧素輝

（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所嘉定園區(qū) 上海 201800）

生物學(xué)家一直渴望使用無損、可實(shí)時(shí)成像的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)行為或者納米尺度的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行研究。由于光學(xué)衍射極限的存在，傳統(tǒng)的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡無法對(duì)200納米尺度內(nèi)的這些生命活動(dòng)進(jìn)行觀察。近年來，克服光學(xué)衍射極限的超分辨成像技術(shù)快速發(fā)展，將分辨率提高至數(shù)十納米級(jí)別?；诔直婕夹g(shù)的熒光顯微鏡包括受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)、光敏定位顯微鏡(PALM)以及隨機(jī)光重建顯微鏡(STORM)。這些技術(shù)日趨成熟并成功應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等研究，為整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展帶來全新的認(rèn)識(shí)。

光學(xué)顯微鏡，超分辨，生物學(xué)，納米，蛋白質(zhì)

生物學(xué)研究往往需要在活細(xì)胞條件下觀察胞內(nèi)組織的活動(dòng)。光學(xué)技術(shù)因其具備對(duì)生物樣品擾動(dòng)最小、實(shí)時(shí)可見的優(yōu)勢，從而成為生物學(xué)觀察的重要技術(shù)手段[1–4]。遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡一直促進(jìn)著人類對(duì)微觀世界的理解，并伴隨著整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的產(chǎn)生和發(fā)展。三百多年以前，Hook等[4]對(duì)成像原理進(jìn)行深入研究，發(fā)明了最早的光學(xué)顯微鏡。利用他發(fā)明并制作的光學(xué)顯微鏡首次觀察到細(xì)菌以及微生物，開創(chuàng)了生物學(xué)領(lǐng)域的新研究。常規(guī)的光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率約200 nm，縱向分辨率400–700 nm，因此，無法觀測納米大小的許多重要的生命體，如病毒和細(xì)胞，以及生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等都無法進(jìn)行觀測。為了揭示細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活動(dòng)和細(xì)胞微結(jié)構(gòu)特征，提高光學(xué)顯微鏡分辨率成為細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展的迫切要求。

1 超分辨成像的重要技術(shù)進(jìn)展

近20年來，克服光學(xué)衍射極限的超分辨顯微鏡不斷發(fā)展，基于熒光的顯微鏡技術(shù)利用分子的熒光能級(jí)躍遷特性、熒光靈敏度高和特異性好的特點(diǎn)，將顯微鏡分辨率提高至納米尺度。超分辨技術(shù)的基本原則是減少或避免處在激發(fā)體積內(nèi)的分子同時(shí)發(fā)射熒光。目前，超分辨顯微成像可以分為兩種方法。第一類是結(jié)合光學(xué)非線性效應(yīng)對(duì)成像的照明光路進(jìn)行整形，獲得小于衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn)。這類技術(shù)的典型代表是Hell等[5]提出的受激發(fā)射損耗顯微鏡(Stimulated emission of depletion microscopy, STED)。同時(shí)，STED也是第一個(gè)用來突破衍射極限的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微技術(shù)，其原理是采用兩束組合激光，一束激光被聚焦成正常的衍射極限焦斑，使焦斑內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；另一束為中心光強(qiáng)為零環(huán)形焦斑分布的損耗光，兩束光進(jìn)行疊加，損耗光通過受激發(fā)射過程損耗周邊區(qū)域內(nèi)的激發(fā)態(tài)熒光分子。因此，周邊區(qū)域內(nèi)的熒光分子被淬滅，只剩下中心的熒光發(fā)光點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)小于衍射極限的熒光發(fā)射面積。從原理上講，由于損耗光的中心光強(qiáng)為零，只要淬滅光足夠強(qiáng)，則由第一束光激發(fā)的熒光分子所占的體積可以被壓縮到極小的范圍內(nèi)，極大提高熒光顯微鏡的分辨率。目前，STED顯微鏡可實(shí)現(xiàn)20 nm分辨率的免疫熒光成像和50–70 nm的熒光蛋白成像[6–17]。

第二類超分辨技術(shù)是基于單分子定位的成像方法，利用光開關(guān)熒光蛋白，光敏化或光漂白現(xiàn)象將衍射極限范圍內(nèi)的單個(gè)分子在不同的時(shí)間隨機(jī)地激活，并將各個(gè)熒光分子精確定位再重組，疊加獲得超分辨圖像。該類技術(shù)通過將相互位置過于靠近而無法被傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡同時(shí)分辨的熒光標(biāo)記分子逐個(gè)予以分別激發(fā)，使各個(gè)熒光分子所成的艾里斑像之間不再相互干擾，從而能夠?qū)γ總€(gè)獨(dú)立的熒光分子逐個(gè)進(jìn)行定位。這樣就可以通過提高時(shí)間分辨率，來達(dá)到改善空間分辨率的目的。這一類技術(shù)的典型代表有光敏定位顯微鏡(Photoactivation localization microscopy, PALM)和隨機(jī)光重建顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)等。

2006年，Betzig等[18]首次使用光敏綠色熒光蛋白作為探針標(biāo)記樣品，利用該光敏綠色熒光蛋白只有在405 nm的激光敏化后，才能被561 nm激發(fā)發(fā)射綠色熒光。他們首先利用低能量的405 nm激光輻照，僅敏化極稀少的光敏蛋白，再使用561 nm激光進(jìn)行激發(fā)直至被記錄的分子發(fā)生光漂白。重復(fù)敏化-激發(fā)-定位-漂白過程，完成足夠多的分子被記錄。這種技術(shù)被稱為光敏定位顯微鏡(PALM)。文獻(xiàn)[19–29]中均介紹了該技術(shù)成果是2006年重要的研究發(fā)現(xiàn)，入選了2006年《Science》十大進(jìn)展。

STORM成像方法與PALM類似，哈佛大學(xué)的Bates等[30,31]提出利用光控?zé)晒夥肿涌蓪?shí)現(xiàn)超分辨成像，即通過激光控制分子在熒光態(tài)和非熒光態(tài)之間轉(zhuǎn)換。實(shí)驗(yàn)中，他們將Cy3和Cy5分子一同修飾在抗體上來標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的蛋白，用532 nm波長的激光敏化探針，632 nm波長的激光來觀察、定位，重復(fù)綠光開啟-紅光激發(fā)-定位-綠光開啟過程，記錄所有分子的位置，疊加組成一幅完整的圖像。在活細(xì)胞成像中，使用明暗轉(zhuǎn)換快速且較亮的探針標(biāo)記樣品，可以讓2D成像的空間分辨率達(dá)到25 nm，而時(shí)間分辨率最快可達(dá)到0.5 s。與PALM相比，雖然兩種成像方法精度相同，但STORM可以重復(fù)記錄，對(duì)熒光分子隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的影響更小[32–39]。

2 超分辨技術(shù)應(yīng)用

近幾個(gè)世紀(jì)以來，遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡一直促進(jìn)著人類對(duì)微觀世界的理解，并伴隨著整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的產(chǎn)生和發(fā)展。盡管許多超分辨方法已經(jīng)在原理上實(shí)現(xiàn)了小于衍射極限的成像效果，但其中很大一部分技術(shù)距離生物學(xué)應(yīng)用較遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步探索和發(fā)展。在這些超分辨技術(shù)中，STED、STORM和PALM發(fā)展較早也日趨成熟，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域的研究，給生物學(xué)發(fā)展帶來了一些全新的發(fā)現(xiàn)。

2.1超分辨技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

隨著超分辨熒光顯微鏡的發(fā)展，很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如微管、肌動(dòng)蛋白和線粒體等，被選為標(biāo)準(zhǔn)模型來驗(yàn)證超分辨技術(shù)的分辨率和可靠性。這些研究不僅展現(xiàn)超分辨熒光顯微鏡的高分辨率，也說明該技術(shù)可以被用于研究分子尺度的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能。其中，胞膜蛋白以及胞膜微區(qū)的研究是超分辨技術(shù)應(yīng)用的重點(diǎn)和難點(diǎn)。因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)太小，無法用常規(guī)的顯微鏡觀察。而超分辨熒光顯微鏡的超分辨能力可以解決這些問題。例如，在細(xì)胞膜研究中，之前用生物化學(xué)的方法測得線粒體膜上的陰離子通道(hVDAC)是與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的己糖激酶-1相結(jié)合的。但Neumann等[14]用雙色STED熒光顯微方法觀察線粒體的結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)大部分的hVDAC并沒有與在線粒體上的己糖激酶-1相結(jié)合。這些研究充分展示了超分辨技術(shù)可以突破生物領(lǐng)域的瓶頸，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)細(xì)胞各蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。

PALM熒光顯微技術(shù)也提供新的視角來觀察質(zhì)膜中的蛋白組織以及胞內(nèi)細(xì)胞器。Bakshi等[40]使用該技術(shù)得到RNA聚合酶在大腸桿菌中的分布及擴(kuò)散過程。同時(shí)English等[41]通過實(shí)時(shí)定位ReIA 分子的擴(kuò)散活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)蛋白的活性隨著分裂周期而發(fā)生變化。Matsuda等[24]在染色質(zhì)的研究中，觀察到染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步提高PALM數(shù)據(jù)的空間分析能力，Burnette等[36]聯(lián)合應(yīng)用PALM熒光顯微技術(shù)和雙色熒光分子標(biāo)記方法，以提高成像的清晰度。并且該新方法被廣泛用于細(xì)胞受體之間相互作用的研究中。例如Betzig等[18]在研究細(xì)胞粘附蛋白的動(dòng)力學(xué)過程中，用該技術(shù)準(zhǔn)確定位兩種不同蛋白在膜上的相對(duì)位置。例外，Sherman等[42]研究了T-淋巴細(xì)胞與TCR(T-Cell antigen Receptor)結(jié)合過程(圖1)。他們清晰地觀測到在T-淋巴細(xì)胞膜上的一系列蛋白中間體和聚集體的結(jié)構(gòu)變化，并且發(fā)現(xiàn)TCR信號(hào)分子存在納米尺度的功能區(qū)。這一結(jié)果擴(kuò)展人們對(duì)T細(xì)胞活化機(jī)制以及TCR蛋白介導(dǎo)的信號(hào)復(fù)合物的形成和組織的理解。因此，PALM熒光顯微技術(shù)不僅可以突破常規(guī)方法的極限、清晰觀測分子尺度的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且為研究蛋白間的動(dòng)態(tài)相互作用提供了更加便捷和可靠的途徑。

圖1 T-淋巴細(xì)胞與TCR結(jié)合的PALM成像Fig.1 PALM imaging of interaction between T-Cell and TCR.

STORM熒光顯微鏡也被用于觀察分子尺度的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其中Bates等[31]利用STROM觀察了細(xì)胞BS-C-1的線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，解析了觀察微管和網(wǎng)格蛋白包被單元。并且證明STORM具有相當(dāng)高的分辨能力，可以突破普通熒光顯微鏡的極限，將分辨出重疊或者不能分解的細(xì)絲。而Huang等[34]進(jìn)一步改進(jìn)了超分辨技術(shù)，并發(fā)明新型的3D STORM顯微技術(shù)。他們結(jié)合使用共聚焦平面三維掃描技術(shù)和折射率錯(cuò)配修正方法獲得了20–30 nm的橫向分辨率和50–60 nm的縱向分辨率。并且得到了清晰的細(xì)胞微管成像，也證明線粒體具有纖薄外殼以及內(nèi)部空心的結(jié)構(gòu)(圖2)。他們提出根據(jù)線粒體外殼形態(tài)，可將與線粒體連接的微管分為細(xì)胞內(nèi)球狀分散結(jié)構(gòu)和管狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)兩類。同時(shí)他們觀察到線粒體與微管之間存在尺蠖式的相互接觸模式。這為線粒體的研究及其運(yùn)輸機(jī)理提供了新的視角，從而進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)與功能。

這些結(jié)果展示了超分辨熒光顯微鏡的發(fā)展，推進(jìn)了細(xì)胞生物學(xué)的研究。生物學(xué)家們期待著用超分辨顯微鏡觀察到更多的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。

圖2 細(xì)胞微管的STORM成像Fig.2 3D STORM image of the mitochondrial network in cell.

2.2超分辨技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用

自從在一個(gè)世紀(jì)之前用光學(xué)顯微鏡觀察到神經(jīng)細(xì)胞后，人們已經(jīng)知道大腦主要的工作方式是通過將信息從神經(jīng)元中的軸突傳送到樹突。而神經(jīng)元的性質(zhì)與突觸結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。為研究神經(jīng)細(xì)胞的性質(zhì)和功能，需要了解突觸的分子尺度的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)。實(shí)際上，突觸的功能是由一個(gè)含有數(shù)百種蛋白的蛋白工廠精確調(diào)控的。研究突觸的功能和結(jié)構(gòu)需要對(duì)樹突位點(diǎn)上的蛋白進(jìn)行精確的定位和研究。因此，完成神經(jīng)細(xì)胞的研究需要既能滿足納米尺度的分辨率，又可以與活體成像相容的方法。而超分辨熒光顯微鏡可以滿足這些苛刻的要求。

Meyer等[43]用STED熒光顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)AMPA受體在神經(jīng)細(xì)胞的突觸上形成一個(gè)環(huán)形的分布。Nagerl[11]則用STED顯微技術(shù)展現(xiàn)了細(xì)胞中的突觸頂端的形狀和結(jié)構(gòu)。Ding等[13]用雙光子STED顯微技術(shù)觀察在深層組織樣品中的突觸頂端的形態(tài)。其中Van等[44]通過超分辨的STED熒光顯微技術(shù)，清晰地觀測到在胞吐作用中起重要作用的受體蛋白syntaxin會(huì)因靜電相互作用而被陰離子脂類PIP2緊緊包裹，并形成72 nm大小微區(qū)(圖3)。同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)在缺少膽固醇時(shí)，PIP2與受體蛋白syntaxin仍能形成這種微區(qū)。這個(gè)結(jié)果說明磷脂雙分子層中的微區(qū)主要是通過蛋白與脂類的靜電作用而形成。這些結(jié)果指出蛋白在細(xì)胞膜中的活動(dòng)與在胞質(zhì)的活動(dòng)的機(jī)理是不同的。

圖3 細(xì)胞膜成像技術(shù)Fig.3 Confocal and corresponding STED image of membrane.

除了研究在神經(jīng)元內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，超分辨顯微鏡也被用來研究神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)。例如，Willig等[7]在突觸結(jié)合蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在胞吐作用后仍處以團(tuán)簇狀態(tài)。Hell等[45]成功地利用STED顯微鏡觀測活鼠大腦皮層神經(jīng)元及其精細(xì)的動(dòng)力學(xué)過程，實(shí)現(xiàn)了高速檢測活細(xì)胞內(nèi)高分辨率圖像，并且分辨率已經(jīng)提高至數(shù)十納米，遠(yuǎn)遠(yuǎn)突破了光學(xué)衍射極限。STED熒光顯微技術(shù)為以后神經(jīng)間相互作用的研究，提供了可靠的方法。

STORM也被用于研究突觸的分子尺度的構(gòu)型。例如，Dani等[46]在神經(jīng)軸突的研究中，利用該技術(shù)成功定論地研究了神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)軸突傳遞的方式以及神經(jīng)突觸在神經(jīng)細(xì)胞上的分布，并且對(duì)突觸中神經(jīng)遞質(zhì)的組成成分進(jìn)行了定量分析。同時(shí)隨著STORM熒光顯微技術(shù)不斷發(fā)展，3D多色STORM的方法取得了諸多成功，并成功用于研究神經(jīng)細(xì)胞中微絲和血影蛋白的組織結(jié)構(gòu)中。Xu等[47]使用多色STORM熒光顯微技術(shù)觀測到微絲蛋白在軸突中形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖4)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)每兩個(gè)微絲蛋白環(huán)之間由一個(gè)血影蛋白連接，并構(gòu)成一個(gè)周期性的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)該環(huán)狀結(jié)構(gòu)與軸突中的鈉離子通道有一定關(guān)聯(lián)，而在樹突中，沒有這種周期性的結(jié)構(gòu)，而是有較長的微絲蛋白存在。

圖4 神經(jīng)突觸的3D STORM成像Fig.4 3D STORM image of actin in a dendritic region.

達(dá)到數(shù)十納米的分辨率可以研究分子級(jí)別的組織和細(xì)胞器，而幾個(gè)納米的分辨率就可以達(dá)到直接觀察分子與分子間反應(yīng)的要求。盡管可以用不同的超分辨顯微鏡得到數(shù)十納米的分辨率，但由于在追蹤軸突在腦神經(jīng)的分布卻需要幾個(gè)納米的分辨率，因此仍需要更高的分辨率。隨著現(xiàn)有超分辨技術(shù)的發(fā)展，在亞神經(jīng)元的研究中會(huì)得到更直觀的結(jié)果。

2.3超分辨技術(shù)在微生物學(xué)中的應(yīng)用

近幾年的研究中，對(duì)于細(xì)菌結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)也在不斷改變與轉(zhuǎn)型中。之前只是簡單地認(rèn)為細(xì)菌體內(nèi)的生物物質(zhì)都是無規(guī)律、隨機(jī)分布的，但現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到細(xì)菌內(nèi)的染色體分工明細(xì)、結(jié)構(gòu)骨架變化不斷并且信號(hào)傳導(dǎo)和生物物質(zhì)合成有著自己的區(qū)域。盡管如此，在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)菌內(nèi)的大部分結(jié)構(gòu)都是一團(tuán)陰影，因此，對(duì)于細(xì)菌內(nèi)的分子構(gòu)成一直處于研究初始狀態(tài)。這是因?yàn)榧?xì)菌的尺寸遠(yuǎn)小于光學(xué)顯微鏡的分辨率，因此，無法對(duì)它們進(jìn)行清晰的結(jié)構(gòu)成像。雖然電子顯微鏡(EM)能夠提供很高的成像分辨率，但是該技術(shù)還無法應(yīng)用于細(xì)菌成像領(lǐng)域。這是因?yàn)樵陔娮语@微鏡成像過程中，一般需要膠體金免疫標(biāo)記方法處理細(xì)菌。但是該方法需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固化處理，因此會(huì)破壞細(xì)菌的內(nèi)結(jié)構(gòu)并影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此電子顯微鏡無法進(jìn)行活體成像。

將眾多的熒光標(biāo)記方法與超分辨顯微鏡結(jié)合，就可以解決細(xì)菌成像問題。該方法已經(jīng)被用來研究細(xì)菌中眾多的蛋白組織結(jié)構(gòu)。例如，Greenfield等[48]用PALM技術(shù)研究趨化蛋白焦油受體CheY 和CheW在大腸桿菌中的分布。Biteen等[49]在新月柄桿菌的研究中，使用PALM熒光顯微鏡給肌動(dòng)蛋白的類似物MreB的成像，發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)為螺旋型。Ptacin等[50]則用類似方法研究了新月柄桿菌內(nèi)的分區(qū)蛋白(Par)的功能。他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)ATP酶與ParA形成一個(gè)狹小、線性的聚體，該聚體穿過細(xì)胞體的中間，與真核細(xì)胞中的紡錘體功能相似。其中，F(xiàn)u等[23]成功用PALM熒光顯微技術(shù)觀察了原核細(xì)胞的分裂過程，特別是FtsZ蛋白在分裂過程中的分布及功能(圖5)。他們清晰地觀測到在細(xì)胞分裂的過程中，該蛋白在細(xì)胞中間形成一個(gè)自組裝蛋白圓環(huán)。該蛋白圓環(huán)作為細(xì)胞分裂的骨架，對(duì)細(xì)胞分裂有著重要作用，并為細(xì)胞分裂研究提供了新的途徑。

圖5 FtsZ蛋白環(huán)的PALM成像Fig.5 PALM imaging of Z-ring in E. coli cells.

Wang等[51]用STORM熒光顯微技術(shù)研究H-NS蛋白在細(xì)菌中的分布及其功能(圖6)。他們發(fā)現(xiàn)H-NS蛋白與DNA結(jié)合并在染色體中形成緊湊的聚集體，將與之結(jié)合的DNA包裹在其中。由于H-NS可以與E.coli基因組的多個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合，這個(gè)形成聚集體的過程可能引起細(xì)菌DNA的折疊、收縮，并充當(dāng)DNA環(huán)的錨點(diǎn)。因此，超分辨技術(shù)可以進(jìn)一步幫助研究H-NS蛋白的工作原理及其DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)形成的過程。

超分辨熒光顯微技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞研究中的應(yīng)用，展示了該技術(shù)在細(xì)菌研究中的巨大潛力?？紤]到對(duì)細(xì)菌中染色體和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究甚少，生物學(xué)家們期待超分辨熒光顯微鏡在未來幾年中，不斷推進(jìn)微生物的發(fā)展。

圖6 H-NS蛋白在細(xì)菌中的成像Fig.6 STORM image of H-NS in E.coli.

2.4超分辨技術(shù)在其它領(lǐng)域中的應(yīng)用

超分辨熒光顯微技術(shù)不僅可以研究細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和作用，也可以對(duì)DNA等遺傳物質(zhì)進(jìn)行單分子成像和研究。由于DNA分子的長度最短僅約50 nm，所以常規(guī)的熒光成像方法無法得到清晰的圖像。Persson等[17]利用STED高分辨率的優(yōu)勢，成功地得到了單個(gè)DNA分子高質(zhì)量的熒光圖像并觀測到單個(gè)DNA分子中的構(gòu)想變化(圖7)。同時(shí)，他們也證明了哺乳動(dòng)物線粒體的內(nèi)核質(zhì)粒大小相同。

STED熒光顯微技術(shù)也被廣泛用于病毒研究中。Chojnacki等[52]利用STED熒光顯微鏡研究了HIV-1(艾滋病病毒)的外殼蛋白(Env)的分布，并發(fā)現(xiàn)HIV病毒外殼蛋白(Env)的分布隨著其成熟作用而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，并最終形成穩(wěn)定的外殼蛋白(Env)三聚體(圖8)。他們清晰地觀測到外殼蛋白Env在胞內(nèi)Gag水解酶的作用下，將隨機(jī)分布在病毒表面的外殼蛋白(Env)進(jìn)行重構(gòu)而形成有序的外殼蛋白(Env)三聚體。在該重構(gòu)作用下，病毒細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)改變從而讓其形態(tài)成熟，并使其能夠侵入靶標(biāo)蛋白CD4并繁殖。這些結(jié)果說明在病毒表面形成外殼蛋白Env在三聚體HIV-1的成熟的重要標(biāo)志。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步解析HIV-1成熟的機(jī)制，也為今后消滅AIDS疾病提供了新的理論依據(jù)。

圖7 DNA成像技術(shù)Fig.7 Confocal and corresponding STED image of DNA.

3 結(jié)論及展望

生物技術(shù)和納米技術(shù)是21世紀(jì)最引人注目的研究領(lǐng)域，而在生命科學(xué)與納米技術(shù)走向融合的今天，研究者更關(guān)注細(xì)胞內(nèi)納米尺度分子的動(dòng)態(tài)過程和結(jié)構(gòu)特征，超分辨熒光顯微技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并在近20年發(fā)展飛速，激勵(lì)大批的科研工作者投身這一研究領(lǐng)域，并作出卓越的貢獻(xiàn)。

超分辨技術(shù)在生物技術(shù)應(yīng)用過程中存在很多難題，如生物樣品的光毒性、活細(xì)胞快速成像的分辨率遠(yuǎn)低于固定樣本、成像速度慢等。為了解決這些難題，近年超分辨技術(shù)的研究熱點(diǎn)集中于提高活細(xì)胞成像的時(shí)空分辨率。研究者繼續(xù)研發(fā)出更穩(wěn)定、效率更高、顏色多樣的熒光染料或熒光蛋白。并嘗試結(jié)合不同成像方法的優(yōu)點(diǎn)，旨在進(jìn)一步提高精度和準(zhǔn)確性。隨著超分辨技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物研究者對(duì)生物有機(jī)體內(nèi)生化反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的觀察將成為現(xiàn)實(shí)，對(duì)人們更加直觀的理解生命現(xiàn)象，揭示各種疾病的發(fā)病機(jī)理，探索新型藥物具有重要的意義。

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CLCTL99

Application of super-resolution optical microscopy in biology

MAO Xiuhai DU Jiancong HUANG Qing FAN Chunhai DENG Suhui
(Shanghai Institute of Applied Physics,Chinese Academy of Sciences,Jiading Campus, Shanghai 201800,China)

Background:A noninvasive, real-time far-field optical microscopy is needed to study the dynamic function inside cells and proteins. However, the resolution limit of traditional optical microscope is about 200 nm due to the diffraction limit of light. So, it’s hard to directly observe the subcellular structures. Over the past several years of microscopy development, the diffraction limit of fluorescence microscopy has been overcome and its resolution limit is about tens of nanometers. Methods: To overcome the diffraction limit of light, many super-resolution fluoresce microcopies, including stimulated emission of depletion microscopy (STED), photoactivation localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), have been developed. Conclusions: These methods have been applied in cell biology, microbiology and neurobiology, and the technology of super-resolution provides a new insight into the life science.

Optical microscopy, Super-resolution, Biology, Nano, Protein

TL99

10.11889/j.0253-3219.2013.hjs.36.060502

毛秀海，男，1986年出生，2008年畢業(yè)于華中科技大學(xué)，現(xiàn)為上海應(yīng)用物理研究所博士研究生，從事納米科學(xué)的研究

鄧素輝，E-mail: dengsuhui@sinap.ac.cn

2013-04-03，

2013-04-20