李 菁，劉 騫，孔保華,*，黃 莉,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.日照職業(yè)技術學院食品工程學院，山東 日照 276826)

L-賴氨酸與3種還原糖美拉德反應產(chǎn)物的理化特性及抗氧化活性

李 菁1，劉 騫1，孔保華1,*，黃 莉1,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.日照職業(yè)技術學院食品工程學院，山東 日照 276826)

研究還原糖種類和反應時間對美拉德反應產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)理化特性和抗氧化活性的影響，采用L-賴氨酸與3種還原糖(D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖)按濃度比1:1、95℃加熱條件進行反應，分別得到0～6h的MRPs，測定MRPs的pH值、吸光度(A294nm和A420nm)、熒光強度、游離氨基含量以及還原能力和ABTS+·清除能力。結果表明：隨著加熱時間的延長，3個體系的pH值逐漸降低(P＜0.05)；無熒光中間產(chǎn)物(A294nm)和褐變產(chǎn)物(A420nm)顯著增加(P＜0.05)；熒光強度在加熱開始1h內急劇增加隨后減小(P＜0.05)；游離氨基的含量逐漸降低(P＜0.05)；同時，MRPs的還原能力和ABTS+·清除活性顯著增加(P＜0.05)。在3種反應體系中，L-賴氨酸與D-半乳糖反應產(chǎn)生的MRPs具有最多的中間產(chǎn)物和最大程度的褐變，以及最強的還原能力和ABTS+·清除能力。由于L-賴氨酸與還原糖反應產(chǎn)生的MRPs具有一定的抗氧化活性和自由基清除能力，所以可以作為一種有效的抗氧化劑應用于食品工業(yè)中。

L-賴氨酸；還原糖；美拉德反應；理化特性；抗氧化活性

美拉德反應(Maillard reaction)是一種在食品熱加工和貯藏過程中廣泛存在的非酶褐變反應，主要是指食品中的羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間發(fā)生的復雜反應，又稱羰胺反應[1]。隨著美拉德反應的進行，會產(chǎn)生一系列復雜的化合物，就是美拉德反應產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)。MRPs廣泛存在于各種食品體系中，對食品的色澤、風味、穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值具有很大的影響[2]。MRPs中含有類黑精、還原酮及一系列含氮、硫的揮發(fā)性雜環(huán)化合物，一些研究表明，這些物質都具有一定的抗氧化活性[3-4]。

比較完全的MRPs有上千種，這些產(chǎn)物的結構和性質十分復雜，不可能一一進行分離鑒定[5]。因此，可以通過建立美拉德反應體系來研究生成物的性質，即用單一的糖與氨基酸反應，通過控制糖的種類和反應條件來生成不同組成的MRPs[6-7]。國內外研究者雖然對氨基酸的MRPs抗氧化活性有一些研究，但是對氨基酸和還原糖種類的選擇，以及反應產(chǎn)物的理化特性和抗氧化活性方面沒有系統(tǒng)地研究。張凌燕等[8]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖分別與天冬酰胺、甘氨酸和精氨酸進行美拉德反應后，產(chǎn)生的MRPs顯示出優(yōu)良的ABTS+·清除活性。Wagner等[9]發(fā)現(xiàn)向玉米油中添加從葡萄糖-甘氨酸的MRPs中分離出來的類黑精，可以延長玉米油的貨架期。Morales等[10]發(fā)現(xiàn)各種氨基酸-葡萄糖MRPs中的類黑精與從咖啡、啤酒或甜酒中提取的類黑精相比，鐵離子螯合能力強。不同種類的糖也會對美拉德反應的速率和產(chǎn)生的MRPs的抗氧化活性產(chǎn)生影響。Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn)果糖、葡萄糖分別和甘氨酸作用時，果糖-甘氨酸比葡萄糖-甘氨酸發(fā)生美拉德反應的速率更快，褐變程度更強。Hwang等[12]通過測定葡萄糖和果糖分別和20種氨基酸反應產(chǎn)生MRPs的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)果糖-氨基酸比葡萄糖-氨基酸產(chǎn)生的MRPs，褐變程度和自由基清除率都高。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)半乳糖-甘氨酸與葡萄糖-甘氨酸相比，褐變速度快。

賴氨酸是人體必需氨基酸，也是很多食源蛋白質的限制性氨基酸。賴氨酸對熱非常敏感，極易發(fā)生美拉德反應，所以賴氨酸的美拉德反應產(chǎn)物普遍存在于各種食品體系中。因此，賴氨酸的MRPs的理化特性和抗氧化活性需要廣泛而深入的研究和認識。本實驗通過測定3種還原糖(D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖)和L-賴氨酸反應不同時間產(chǎn)生MRPs的理化性質(pH值、A294nm、A420nm、熒光強度、游離氨基含量)和抗氧化活性(還原能力和ABTS+·清除能力)，系統(tǒng)分析還原糖種類和反應時間對MRPs理化特性和抗氧化效果的影響，為尋找和應用新型的食用色素和食品抗氧化劑提供新的思路，以期為今后的食品生產(chǎn)中MRPs的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸、D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、鐵氰化鉀、三氯化鐵 上海國藥集團化學試劑有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠；UV-6000PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；TGL-16C型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；JD500-2型電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應產(chǎn)物(MRPs)的制備

分別稱取一定量的L-賴氨酸和還原糖(D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖)，加入蒸餾水使之完全溶解，并定容至100mL，使溶液中賴氨酸和還原糖的濃度均為0.3mol/L。取上述溶液10mL轉移到25mL的具塞試管中，蓋緊。在95℃水浴中加熱0～6h，并每隔一段時間取樣，然后立即放入冰水中冷卻。獲得的MRPs在4℃條件下保存，用于分析其理化特性和抗氧化活性。

1.3.2 美拉德反應產(chǎn)物pH值的測定

在反應的不同時間，用pH計測定MRPs的pH值。

1.3.3 中間產(chǎn)物和褐變程度的測定

參照Ajandouz等[14]的方法。用蒸餾水將MRPs稀釋100倍，用UV-6000PC分光光度計在294nm波長處測定吸光度，并在420nm波長處測定MRPs的褐變程度，作為晚期褐色聚合物形成的指標。

1.3.4 熒光強度的測定

參照Morales等[15]的方法，并稍作修改。將MRPs樣品稀釋1000倍，用F-4500熒光分光光度計在347nm的激發(fā)波長和415nm的發(fā)射波長測定熒光強度。

1.3.5 游離氨基含量的測定

參照Benjakul等[16]的方法，100倍稀釋的MRPs樣品125μL與2.0mL pH值為8.2、0.2125mol/L的磷酸鹽緩沖液相混合，再加入1.0mL 0.01%的TNBS溶液。充分混合均勻，在50℃水浴中避光保溫30min。再加入2.0mL 0.1mol/L的亞硫酸鈉終止反應。室溫條件下冷卻15min，在420nm波長測定吸光度。以L-亮氨酸為標準物，按上述方法繪制出亮氨酸濃度與吸光度之間的標準曲線回歸方程，根據(jù)測定樣品的吸光度，利用標準曲線方程，計算得出樣品中的游離氨基含量。

1.3.6 還原能力的測定

參照Yen等[17]的方法，并稍作修改。取100倍稀釋的樣品0.5mL，加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH值為6.6)和2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，混合均勻。將混合物在50℃水浴保溫20min，再加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3000×g離心10min。取2.5mL上層清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1g/100mL的三氯化鐵溶液，混合均勻，在700nm波長處測其吸光度。

1.3.7 ABTS+·清除活性的測定

參照Re等[18]的方法，并稍作修改。用pH4.5的醋酸鈉緩沖溶液配制7mmol/L的ABTS儲備液，ABTS儲備液和最終濃度為2.45mmol/L的過二硫酸鉀反應產(chǎn)生ABTS+·，混合物預先在室溫黑暗處放置12～16h。穩(wěn)定后的ABTS+·溶液，用pH4.5、20mmol/L醋酸鈉緩沖溶液稀釋，使其在734nm波長處的吸光度為0.70±0.02。取3mL該溶液與100μL MRPs樣品(100倍稀釋)充分混合，避光放置6min，在734nm波長處測定吸光度。按照下式計算ABTS+·清除率。

式中：Ac為反應前ABTS+·溶液的吸光度；As為反應后樣品溶液的吸光度。

1.4 統(tǒng)計方法

每個實驗重復3次，結果表示為x ±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1 (分析軟件，St Paul, MN)軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 9.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 L-賴氨酸和不同還原糖美拉德反應產(chǎn)物pH值的變化

圖 1L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應產(chǎn)物pH值的變化Fig.1 Change in pH of various lysine-sugar MRPs during different heating times

由圖1可知，隨著加熱時間的延長，各反應體系的pH值呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，從開始的9.45～9.72之間，下降到5.90～7.50之間。這與Lertittikul等[19]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖-蛋白質美拉德反應體系的pH值隨加熱的進行而顯著降低。而且，不同的還原糖對反應體系的pH值有較大的影響，D-半乳糖-L-賴氨酸反應體系的pH值相對于葡萄糖和果糖體系來說，下降最為顯著(P＜0.05)。還原糖在高pH值加熱時，很容易降解產(chǎn)生甲酸和乙酸等化合物[20]，由于這些酸性物質的產(chǎn)生，使得MRPs的pH值隨著加熱時間的增加而降低。其他類型的酸，如乳酸、丙酸、檸檬酸和糖精酸也可能在美拉德反應期間生成[21]。另外，反應初始時，體系的pH值主要取決于L-賴氨酸，它有兩個—NH2，屬于堿性氨基酸，但隨后發(fā)生的縮合反應封閉了游離的—NH2，致使反應體系pH值下降。因此，能夠推斷出氨基的消耗和酸的產(chǎn)生可能是美拉德反應體系中pH值下降的原因[22]。在美拉德反應的中間階段，由于一些具有緩沖能力的酸性化合物的產(chǎn)生，包括甲酸、醋酸、丙酮醛、乙二醛等，抑制了美拉德反應體系的酸性，所以當加熱時間延長時，pH值的降低趨于平穩(wěn)狀態(tài)。

2.2 中間產(chǎn)物和褐變程度的變化

圖 2L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應中間產(chǎn)物(a)和褐變程度(b)的變化Fig.2 Change in non- fl uorescent intermediate products (a) and browning degree (b) of various lysine-sugar MRPs during different heating times

294nm波長處吸光度的增加表明了無熒光化合物的形成，這種化合物是褐色素形成的前體物[23]。由圖2a可知，隨著加熱時間的延長，無熒光中間產(chǎn)物(A294nm)顯著增加(P＜0.05)。D-半乳糖-L-賴氨酸美拉德反應體系產(chǎn)生的無熒光中間產(chǎn)物最多，而且速度最快。這一結果與Benjakul等[24]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)還原糖-豬血漿蛋白MRPs在294nm波長處吸光度隨著加熱的進行而逐漸上升，并且D-半乳糖作用產(chǎn)生的MRPs的吸光度有最大程度的增加。

MRPs在420nm波長處吸光度的增加表明美拉德反應最后階段褐色素的產(chǎn)生。由圖2b可知，隨著反應的進行，反應體系的褐變程度(A420nm)顯著增加。而且，D-半乳糖-L-賴氨酸體系的褐變程度要顯著高于其他兩種還原糖反應體系(P＜0.05)。同時，在D-葡萄糖和D-果糖體系中，兩者的中間產(chǎn)物和褐變程度差異不顯著(P＞0.05)。美拉德反應的最后階段發(fā)生的反應是氨基酸和糖片段縮合成聚合蛋白和褐色素類黑精[25]。反應時間越短，MRPs的顏色越淺，隨著反應時間的延長，420nm波長處的吸光度增加，溶液顏色逐漸加深，表明形成了褐色聚合體——類黑精。類黑精是MRPs中的主要抗氧化成分。因為類黑精是一種以短肽和色素相結合的混合體，美拉德反應時間越長，有利于色素物質產(chǎn)生，從而加深了反應產(chǎn)物的褐變程度[26]。美拉德反應中還原糖的種類影響褐變的速度。還原糖的活動性有如下順序：五碳醛糖＞己醛糖＞已酮糖＞二糖[27]。因此，D-半乳糖-L-賴氨酸反應體系褐變程度最大。不同研究中產(chǎn)生的差異，可能是由于糖、蛋白質、氨基酸的差異性和制備MRPs條件的差異。

2.3 熒光強度的變化

圖 3L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應產(chǎn)物熒光強度的變化Fig.3 Change in fl uorescence intensity of various lysine-sugar MRPs during different heating times

由圖3可知，隨著加熱時間的延長，L-賴氨酸與各還原糖反應體系的熒光強度都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(P＜0.05)。其中D-半乳糖-L-賴氨酸反應體系的熒光強度在加熱到1h時達到最大值，隨著加熱的繼續(xù)進行，熒光強度呈下降趨勢(P＜0.05)；同時，D-葡萄糖和D-果糖反應體系的熒光強度在加熱到2h時才達到最大值，后隨加熱時間的延長而顯著下降(P＜0.05)。

熒光化合物可能是褐色素的前體物，在褐色素之前形成[28]。隨著美拉德反應的進行，熒光化合物開始積累，MRPs熒光強度增加。繼續(xù)加熱，可能是由于熒光中間產(chǎn)物轉化形成褐色素的速度快，就導致熒光中間產(chǎn)物的減少，熒光強度隨之降低。這一結果與Jing等[29]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)還原糖-L-賴氨酸反應體系在121℃，初始pH值為9的條件下加熱時，MRPs的熒光強度在0.5h內達到最大值，在繼續(xù)加熱的2h熒光強度逐漸下降。在美拉德反應進行中會產(chǎn)生兩種不同的中間產(chǎn)物(熒光化合物和無熒光化合物)，它們會以不同的速度經(jīng)歷反應的最后階段[30]。當加熱進行到一定程度時，熒光強度會下降。因此可知，熒光化合物形成褐色素的速度要比無熒光化合物的速度快得多。形成中間產(chǎn)物的類型和多少，取決于糖的種類和加熱時間。在還原糖-L-賴氨酸反應體系中，D-半乳糖-L-賴氨酸產(chǎn)生了最多的熒光化合物和無熒光化合物，而D-果糖-L-賴氨酸產(chǎn)生的熒光化合物最少，D-葡萄糖-L-賴氨酸產(chǎn)生的無熒光化合物最少。

2.4 游離氨基含量的變化

圖 4L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應產(chǎn)物游離氨基含量的變化Fig.4 Change in free amino groups of various lysine-sugar MRPs during different heating times

在美拉德反應過程中，游離氨基含量的變化在一定程度上，反映了美拉德反應的進程，反應越徹底，消耗的游離氨基酸越多[31]。由圖4可知，隨著加熱時間的延長，L-賴氨酸與各還原糖反應體系中的游離氨基含量都呈現(xiàn)出下降趨勢(P＜0.05)，尤其在0～3h的加熱時間內，各體系中游離氨基含量明顯持續(xù)下降(P＜0.05)。這個結果表明，當加熱進行時，蛋白質或氨基酸的α-或ε-NH2基團更大程度的與糖共價結合形成糖基化蛋白。一個糖基化產(chǎn)物重新排列成一個更穩(wěn)定的酮胺或阿馬杜里產(chǎn)物(Amadori product)。然后，阿馬杜里產(chǎn)物與相鄰的蛋白質或與其他氨基交聯(lián)，最后產(chǎn)生高級糖化的最終產(chǎn)品[32]。因為L-賴氨酸有兩個α-和ε-氨基，它就可能比其他氨基酸有更高的反應活性。相反的，硫磺氨基酸和多肽類，例如半胱氨酸和谷胱甘肽通常能有效的抑制美拉德反應[33]。

2.5 還原能力的變化

圖 5L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應產(chǎn)物還原能力的變化Fig.5 Change in reducing power of various lysine-sugar MRPs during different heating times

通常樣品的還原能力與其抗氧化能力呈正相關。由圖5可知，隨著加熱時間的延長，各體系中的MRPs的還原能力顯著增加(P＜0.05)。相對于D-果糖來說，D-半乳糖和D-葡萄糖體系中產(chǎn)生的MRPs都表現(xiàn)出較高的還原能力(P＜0.05)，尤其在加熱時間延長時。D-半乳糖體系中MRPs的還原能力始終最強(P＜0.05)。MRPs可以提供電子，起到還原作用，這與Kim等[34]的研究結果一致，他們發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖和3種氨基酸(甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、三甘氨酸)反應體系MRPs的還原能力隨加熱時間的增加而增加。Yoshimura等[34]指出，在D-葡萄糖-L-賴氨酸MRPs中存在許多能消除過氧化物的化合物(主要存在于褐色素中)，過氧化物間接引發(fā)脂類氧化。另外，MRPs顯著抗氧化能力很可能與它們強有力消除過氧化物有關。他們研究還表明，隨著反應時間的延長，抗氧化能力顯著增加，而經(jīng)脫色處理的MRPs抗氧化能力卻顯著下降，這也就說明色素物質的抗氧化作用。

2.6 ABTS+·清除活性的變化

圖 6L-賴氨酸和不同還原糖在不同加熱時間反應產(chǎn)生的美拉德反應清除活性的變化Fig.6 Change inABTS產(chǎn)物ABTS+· · scavenging activity of various lysine-sugar MRPs during different heating times+

由圖6可知，隨著加熱時間的延長，各還原糖體系MRPs的ABTS+·清除活性顯著增強(P＜0.05)。在相同加熱時間的條件下，D-半乳糖作用得到的MRPs的ABTS+·清除活性最強(P＜0.05)，其次是D-葡萄糖和D-果糖。以加熱6h為例，D-半乳糖產(chǎn)生的MRPs對ABTS+·清除活性可達48.05%，而D-果糖產(chǎn)生的MRPs的ABTS+·清除活性最低，僅為36.59%。

尹姿等[35]研究發(fā)現(xiàn)，木糖-甘氨酸產(chǎn)生的MRPs對ABTS+·的清除能力隨著加熱時間的延長而逐漸增強；同時，隨著反應產(chǎn)物質量濃度的增大，其清除率逐漸增大，到質量濃度為3.2mg/mL時，ABTS+·清除率達到了98.5%左右。這與本實驗的結果相符合。Hayase等[36]的研究表明MRPs中的Blue-M1對自由基的清除能力可以和類黑精相媲美。因此，還原糖-L-賴氨酸反應體系MRPs的自由基清除能力可能是由于多種機制所構成的。例如MRPs中含有揮發(fā)性雜環(huán)化合物如噻吩、噻唑、吡咯等，因其具獨特化學結構而有抗氧化效果。具有芳香特性的五元和六元雜環(huán)化合物中6個π電子非定域分布于環(huán)上，使碳原子上電子過剩。由于碳原子上π電子云密度提高而有助于自由基親電加成，起到清除自由基效果。Morales等[15]的研究表明自由基清除活性和熒光強度之間沒有關系，但是卻與褐變程度和中間產(chǎn)物的生成呈正相關。由于還原糖-L-賴氨酸反應體系中的MRPs具有很強的還原能力和ABTS+·清除活性，因此可以作為一種抗氧化劑來防止食物的脂質氧化。

3 結 論

L-賴氨酸與3種還原糖的美拉德反應是一個酸度和褐變不斷增強的反應。在反應體系中，均有一定的新物質產(chǎn)生，并且反應生成的MRPs是具有良好的抗氧化功能，其中L-賴氨酸與D-半乳糖反應得到的MRPs表現(xiàn)出最高程度的褐變和最好的還原能力以及自由基清除能力。因此，L-賴氨酸與還原糖的MRPs不僅可以用于食品的著色，而且可以預防體內許多由自由基損傷引起的疾病，起到一定的保健作用。

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Physico-chemical Properties and Antioxidant Activity of Maillard Reaction Products from L-lysine and Reducing Sugar Model System

LI Jing1，LIU Qian1，KONG Bao-hua1,*，HUANG Li1,2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Food Engineering, Rizhao Polytechnics, Rizhao 276826, China)

In this study, the effect of reducing sugar type and reaction time on physicochemical properties and antioxidant activity of Maillard reaction products (MRPs) prepared by heating the mixture of L-lysine and reducing sugars (D-glucose, D-fructose and D-galactose) at the molar ratio of 1:1 for 0—6 h in 95 ℃ water bath was investigated. The pH, absorbance (A294nmand A420nm), fl uorescence intensity, free amino group content, reducing power and ABTS+· scavenging activity of MRPs were also determined. The results showed that as the increase of heating time, the pH of the model system revealed a significant decrease (P＜0.05); non-f l uorescent intermediate products (A294nm) and browning products (A420nm) revealed a significant increase (P＜0.05); fl uorescence intensity revealed a sharp increase within1 h and a subsequent decrease (P＜0.05); free amino group content exhibited a gradual decrease (P＜0.05); and the antioxidant activity of MRPs revealed a significant increase (P＜0.05) evaluated by reducing power and ABTS+· scavenging activity. MRPs derived from L-lysine and D-galactose model system provided the largest amount of intermediate and browning products, and also possessed higher reducing power and ABTS radical scavenging activity among three systems. Because of its antioxidant activity and radical scavenging activity, MRPs from L-lysine and reducing sugar model system could be a potent antioxidant in food industry.

L-lysine；reducing sugar；Maillard reaction；physico-chemical properties；antioxidant activity

TS251.1

A

1002-6630(2013)03-0080-06

2011-11-16

黑龍江省高等學?？萍紕?chuàng)新團隊建設計劃項目(2010td11)

李菁(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：yijing887176@163.com

*通信作者：孔保華(1963—)，女，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：kongbh@163.com