嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混菌生物膜發(fā)酵特性及其抗逆性

瑪依諾·木圖拉，王 坤，陳曉紅，姜 梅，李 偉，董明盛,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混菌生物膜發(fā)酵特性及其抗逆性

瑪依諾·木圖拉1,2，王 坤1，陳曉紅1，姜 梅1，李 偉1，董明盛1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

利用掃描電子顯微鏡對嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)在不銹鋼網(wǎng)布及椰果粒表面形成的混菌生物膜進(jìn)行觀察，并對不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜發(fā)酵特性及其抗逆性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus可在兩種載體表面形成典型的混菌生物膜結(jié)構(gòu)，且不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜的發(fā)酵液菌體密度變化曲線與細(xì)菌S型生長曲線相似，但在停滯期和對數(shù)期不明顯，發(fā)酵液pH值呈現(xiàn)先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢，終止pH值接近4.0；此外，不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜比游離乳酸菌具有更強(qiáng)的抗性，并且可在15d內(nèi)穩(wěn)定地釋放較高濃度的游離乳酸菌。

乳酸菌；生物膜；發(fā)酵

細(xì)菌生物膜(biofilm)是一種附著于細(xì)菌體表或界面由細(xì)菌群體和包裹菌體的水合性基質(zhì)組成的聚合體[1-2]，生物膜成熟后可以釋放游離菌體。與普通游離細(xì)菌相比，生物膜細(xì)菌和生物膜釋放細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗逆性。由于生物膜細(xì)菌在生理、代謝、對底物的降解或利用和對環(huán)境的抵抗能力等方面具有獨(dú)特的性質(zhì)[3-5]，生物膜的研究近年來備受重視。

目前，細(xì)菌生物膜已在多個領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用，如環(huán)境修復(fù)工程(水體脫氮[6]、生物修復(fù)、吸附重金屬[7])和能源產(chǎn)業(yè)(氫氣制造[8])。然而，關(guān)于乳酸菌生物膜方面的研究和應(yīng)用還相對較少，Speranza等[9]研究利用乳酸菌生物膜來控制軟質(zhì)干酪中李斯特氏菌的生長，Rangaswamy等[10]研究過利用德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii)生物膜來連續(xù)生產(chǎn)乳酸。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是益生菌典型代表，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，利用其生物膜或生物膜釋放菌體進(jìn)行生產(chǎn)，既可以獲取優(yōu)良菌體又可以節(jié)約發(fā)酵劑，提高經(jīng)濟(jì)效益。本實驗以保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的混菌生物膜為研究對象，對其結(jié)構(gòu)、發(fā)酵特性、抗逆性及其作為連續(xù)接種源的可能性進(jìn)行研究，以期為乳酸菌混菌生物膜在未來的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

不銹鋼網(wǎng)布(300目) 河北省安平縣天瑞金屬制品廠；椰果粒 福建省泉州喜多多食品有限公司。載體規(guī)格見表1。載體使用前先在95%乙醇中浸泡30min，然后再用無菌生理鹽水浸泡清洗數(shù)次以除去殘留乙醇。

表1 載體規(guī)格Table1 Specification of carriers

1.2 菌種、培養(yǎng)基與試劑

嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、保加利亞乳桿菌(L. bulgaricus)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室自行分離和保存。

MRS液體培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[11]方法配制。

2.5 %戊二醛溶液[11]；生理鹽水；LIVE/DEAD Baclight熒光染色試劑盒 美國Molecular Probes公司。

1.3 儀器與設(shè)備

UP3200H超聲波清洗器 熊貓集團(tuán)南京電子計量有限公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Leica TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；GJB發(fā)酵控制系統(tǒng) 江蘇大學(xué)生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 混菌生物膜的培養(yǎng)

采用置片法[12]培養(yǎng)混菌生物膜：將處理后的不銹鋼網(wǎng)布和椰果粒置于無菌MRS液體培養(yǎng)基中，按酸乳生產(chǎn)接種時1:1(V/V)的比例，以1%接種量接種S. thermophilus和L. bulgaricus，37℃靜置培養(yǎng)，每24h更換一次新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7d，使其在載體表面形成成熟生物膜。

1.4.2 混菌生物膜的觀察

將樣品用2.5%戊二醛溶液固定，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

1.4.3 混菌生物膜的發(fā)酵實驗

首先向2.5L小型發(fā)酵罐中注入2L MRS液體培養(yǎng)基，然后接入S.thermophilus和L.bulgaricus(接菌比例、接種量同上)，37℃靜置培養(yǎng)2d后每24h更換一次新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速105r/min、37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)5d以形成成熟生物膜。生物膜形成后先用2.5L生理鹽水連續(xù)清洗發(fā)酵罐2次，再加入2L MRS新鮮液體培養(yǎng)基開始發(fā)酵：24h之前，每2h取一次樣，之后每4h取一次樣。對樣品進(jìn)行pH值和菌體密度的測定。

1.4.3.1 發(fā)酵液pH值的測定

發(fā)酵液pH值由發(fā)酵控制系統(tǒng)配備pH探頭直接測得。

1.4.3.2 發(fā)酵液菌體密度的測定

菌體密度采用平板計數(shù)法測定，根據(jù)稀釋倍數(shù)和涂布取樣量即可換算出樣品的含菌量[13]，以每毫升樣品的菌落數(shù)(CFU/mL)表示。

1.4.4 不銹鋼網(wǎng)表面混菌生物膜的抗性研究

1.4.4.1 混菌生物膜抗性實驗

首先將3片附有成熟混菌生物膜的不銹鋼網(wǎng)布用無菌生理鹽水清洗3次，然后分別裝入3個盛有10mL 50℃無菌MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中水浴5min，結(jié)束后立即取出網(wǎng)布置入另一相同三角瓶中，室溫超聲波(200W)處理3min[14]，取三角瓶中液體計菌數(shù)。對照為37℃條件下相同處理。pH 2.0條件下的抗性實驗同上。

1.4.4.2 懸浮液混菌抗性實驗

取37℃條件下培養(yǎng)18h的游離混菌菌液10mL離心5min(6000r/min、4℃)，然后棄去上清向菌體沉淀中加入10mL 50℃無菌MRS液體培養(yǎng)基，迅速取出5mL移入10mL無菌離心管并混勻取樣0.5mL計數(shù)，其余部分50℃水浴5min后計數(shù)。pH 2.0條件下的抗性實驗同上?？剐詮?qiáng)弱依據(jù)處理后菌體存活率大小確定。

1.4.5 乳酸菌混菌生物膜作為連續(xù)接種源的研究

待攪拌槳上形成成熟的混菌生物膜后，對生物膜釋放游離菌體的能力進(jìn)行測定。具體方法如下：排出發(fā)酵液后，首先用無菌生理鹽水將發(fā)酵罐連續(xù)沖洗3次，以洗掉表面附著菌體。然后向發(fā)酵罐中注入2L無菌生理鹽水(105r/min，37℃)，3min后排出液體并取樣計數(shù)。此步驟重復(fù)進(jìn)行5次。計數(shù)完畢，重新向發(fā)酵罐中注入2L新鮮MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h(105r/min，37℃)。此即為一個循環(huán)。實驗共15個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

圖1 椰果粒(a)和不銹鋼網(wǎng)布(b)載體上混菌生物膜電子顯微鏡圖Fig.1 Images of mixed-species biofilm on different carriers examined by SEM

2.1 混菌生物膜的電鏡觀察結(jié)果由圖1可知，S. thermophilus和L. bulgaricus在兩種載體表面上可以形成典型的混菌生物膜，菌體與菌體之間緊密排列，共同粘聯(lián)在載體表面。同時，生物膜的典型結(jié)構(gòu)——生物膜孔道(圖中空隙部分，用于細(xì)胞之間營養(yǎng)物質(zhì)的傳送和代謝廢物的排出)也清晰可見。至此可知S. thermophilus和L. bulgaricus可以在不銹鋼網(wǎng)布和椰果粒表面形成典型的混菌生物膜。

2.2 混菌生物膜發(fā)酵液菌體密度的變化

圖2 混菌生物膜發(fā)酵液菌體密度變化曲線Fig.2 Change curve of bacterial colony number in the broth fermented by mixed-species biofilm

由圖2可知，0～20h時，菌體密度增速較快，24h后，菌體密度達(dá)到最大值(超過108CFU/mL)并基本趨于平穩(wěn)，而28h后有略微下降趨勢?；炀锬ぐl(fā)酵液菌體密度變化曲線和細(xì)菌S型生長曲線比較相似，但停滯期和對數(shù)期不明顯。分析其原因，可能是因為成熟生物膜可以持續(xù)釋放菌體，但釋放菌體對環(huán)境的適應(yīng)還需要一定時間，而一定環(huán)境的細(xì)菌容納量是有限的，這就造成發(fā)酵液菌體密度接近最高時而大部分釋放菌體尚未達(dá)到最大活力，所以停滯期和對數(shù)期不明顯。

2.3 混菌生物膜發(fā)酵液pH值的變化

圖3 乳酸菌混菌生物膜發(fā)酵液pH值變化曲線Fig.3 pH change curve of the broth fermented by mixed-species biofilm

由圖3可知，隨著時間的延長，發(fā)酵液pH值呈逐漸下降的趨勢，24h后下降趨勢變緩，有趨于平穩(wěn)的態(tài)勢，發(fā)酵液終止pH值接近4.0。這與游離保加利亞乳桿菌32h發(fā)酵液pH值差異不大(3.96)[15]，說明生物膜乳酸菌與游離乳酸菌具有相似的產(chǎn)酸能力。

2.4 混菌生物膜和游離菌體抗性實驗結(jié)果

圖4 不同條件下游離細(xì)菌與不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜菌體存活率的比較Fig.4 Comparison of survival rates between planktonic and mixedspecies biofilm on stainless steel under different conditions

由圖4可知，不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜在50℃和pH2.0條件下處理5min 后，菌體存活率分別為72.4%和44.5%遠(yuǎn)大于混菌懸浮液菌體的26.37%和6.2%。說明混菌生物膜菌體比游離菌體具有更強(qiáng)的抗逆性。

2.5 乳酸菌混菌生物膜釋放游離菌計數(shù)

圖5 乳酸菌混菌生物膜釋放游離菌數(shù)變化曲線Fig.5 Change curve of free bacteria released by mixed-species biofilm

由圖5可知，在15次循環(huán)中，乳酸菌混菌生物膜每次沖洗時釋放的游離菌數(shù)都在106CFU/mL或106CFU/mL以上，雖然每次循環(huán)隨著沖洗次數(shù)的增加，菌體濃度有略微下降趨勢，但幅度并不明顯，說明乳酸菌混菌生物膜具有較高和穩(wěn)定的菌體釋放能力，具有作為連續(xù)接種源的潛力。

3 結(jié) 論

利用掃描電子顯微鏡對S. thermophilus和L. bulgaricus在不銹鋼網(wǎng)布和椰果粒表面形成的乳酸菌混菌生物膜進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，S.thermophilus和L.bulgaricus可在不銹鋼網(wǎng)和椰果粒表面可以形成典型的混菌生物膜，然后對不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜的發(fā)酵特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不銹鋼網(wǎng)布表面混菌生物膜發(fā)酵液菌體密度變化曲線類似細(xì)菌S型生長曲線，但在停滯期和對數(shù)期不明顯，生物膜乳酸菌發(fā)酵液pH值呈現(xiàn)先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢，終止pH值接近4.0，賀銀鳳等[16]對乳酸菌固定化工藝參數(shù)及發(fā)酵特性進(jìn)行研究時固定化乳酸菌發(fā)酵牛乳pH值變化趨勢與此相似。除此之外，本實驗對乳酸菌混菌生物膜的抗逆性和釋放菌體的能力也做了一些研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌混菌生物膜具有較高的抗性并能穩(wěn)定地釋放菌體，這為乳酸菌混菌生物膜在未來的應(yīng)用提供了可能。

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Fermentation Performance and Resistance of Biofilm Formed by Mixed Bacterial Strains of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

Mahinur·MUTUVULLA1,2，WANG Kun1，CHEN Xiao-hong1，JIANG Mei1，LI Wei1，DONG Ming-sheng1,*

(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Life Sciences, Xinjiang Normal University, ürümqi 830052, China)

In this study, the biofilm on coconut or stainless mesh formed by mixed bacterial strains such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus was observed by scanning electron microscope, and then the preliminary study on fermentation performance and resistance of the generated biofilm on stainless mesh was conducted. The results showed that S. thermophilus and L. bulgaricus could form typical mixed-species biofilm on coconut and stainless mesh, and the change curve of bacterial density from the broth fermented by mixed bacterial strains on stainless mesh was S-shaped growth curve, while the lag phase and logarithmic phase was not obvious. The pH of the broth fermented by mixed-species biofilm revealed a decrease in the early stage and then a stable level in the late stage with the final pH close to 4.0. In addition, the mixed-species biofilm had stronger resistance than free bacteria.

lactic acid bacteria；biof i lm；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2013)03-0169-04

2012-02-24

國家“863”計劃項目(2011AA100903)；江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2011651)；教育部博士點基金(新教師類)項目(20110097120028)；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金項目(KJ2010018)

瑪依諾·木圖拉(1982—)，女，碩士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：849180636@qq.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn