張 寧，劉 元

近年來(lái)，探討炎癥反應(yīng)在缺血性腦梗死中的損傷機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)，抗炎治療被認(rèn)為是改善腦梗死病情，降低腦卒中患者致殘致死率的有前景的治療方法之一。過(guò)氧化物酶體增殖激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)屬于Ⅱ型核受體超家族成員，受配體激活后能調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，除降低血糖水平外，尚可改善動(dòng)脈粥樣硬化、糾正血脂紊亂、抗臟器纖維化等，新近［1～3］研究發(fā)現(xiàn)PPARγ 選擇性激動(dòng)劑噻唑烷二酮類藥物(TZDs)參與多臟器缺血再灌注后炎癥反應(yīng)過(guò)程，但其機(jī)制尚未清楚。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)采用TZDs 類藥物馬來(lái)酸羅格列酮(RSG)對(duì)大鼠缺血再灌注后進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察各組大鼠腦梗死體積及炎癥因子白介素-18(IL-18)表達(dá)變化，試圖為腦卒中抗炎治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 250～280g 清潔級(jí)健康雄性成年SD 大鼠60 只(湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，隨機(jī)分為5 組:假手術(shù)組(n=12)，缺血再灌注模型組(n=12)，羅格列酮0.5mg/kg、2mg/kg、5mg/kg 大中小3 種劑量干預(yù)組(3 組各n=12)。Longa 線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型(MCAO)。羅格列酮干預(yù)組于缺血即刻及缺血2h 后經(jīng)插入胃管分別灌入馬來(lái)酸羅格列酮0.5mg/kg、2mg/kg、5mg/kg 大中小3 種劑量。假手術(shù)組和模型組以相同體積的生理鹽水灌胃，在缺血2h 再灌注24h 后處死大鼠。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品 羅格列酮(rosiglitazone)購(gòu)自葛蘭素史克公司，IL-18 抗體購(gòu)買自美國(guó)Millipore 公司，PV6001 二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒，由北京中杉金橋生物公司提供，其余試劑由湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注動(dòng)物模型制備及評(píng)分參考Longa 的線栓法制備局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血模型。主要步驟包括:10%水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后分別予以結(jié)扎，頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端作血管切口，沿頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入頭端鈍化的尼龍栓線約18±5mm 阻塞大腦中動(dòng)脈入口，缺血2h 后拔出栓線進(jìn)行24h 再灌注。假手術(shù)組插線深度為8～10mm，其余同模型制備。根據(jù)Longa 的5 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分并記錄，其中1～3 分為造模成功。沒(méi)有神經(jīng)功能缺損、有呼吸困難、提前死亡及處死時(shí)發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的動(dòng)物均排除。手術(shù)中出血過(guò)多的動(dòng)物也棄去。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中死亡或者剔除的大鼠嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一補(bǔ)充。將制作成功的模型麻醉后4%多聚甲醛進(jìn)行灌注，取自額極起4～11mm 之間的腦組織4%多聚甲醛固定過(guò)夜，依次脫水、透明、浸蠟、包埋。將包埋好的石蠟組織塊修材，自大腦向后以冠狀切面連續(xù)切片，每片厚5μm，收集含缺血區(qū)的腦片貼片、烤片。

1.2.2 IL-18 免疫組化染色檢測(cè) 用兔抗大鼠IL-18 多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每個(gè)指標(biāo)取兩張切片。(1)石蠟切片脫蠟:石蠟切片置60 ℃烤箱烤片15h 以上→從烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無(wú)水乙醇2min→95%乙醇2min→80%乙醇→70%乙醇→自來(lái)水洗。(2)3%H2O2阻斷20min(以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，降低背景);PBS 洗3 次，每次3min。(3)抗原修復(fù)(檸檬酸pH 6.0 修復(fù)10min);PBS 洗3 次，每次3min。(4)滴加5%正常山羊血清封閉，37℃，10～20min(消除背景非特異性著色)。(5)吸干組織周圍多余的血清，不洗，滴加第一抗體，37℃孵育30min 再4℃冰箱過(guò)夜;PBS 洗3 次，每次3min。(6)擦干組織周圍PBS，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育20min，PBS 洗3 次，每次3min。(7)擦干組織周圍PBS，滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，37℃孵育20min。(8)PBS洗3 次，每次3min，蒸餾水洗2 次，DAB 顯色(DAB必須現(xiàn)用現(xiàn)配)，鏡下控制顯色程度，顯色約5min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染胞核30s，烤干，中性樹膠封片。在生物學(xué)顯微鏡下觀察腦缺血側(cè)皮質(zhì)IL-18陽(yáng)性細(xì)胞，在40×10 倍顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，圖像分析軟件(Image-proplus-6，美國(guó))分析計(jì)算每張切片中所選中區(qū)域平均光密度值(AOD)。

1.2.3 病理學(xué)觀察 石蠟切片HE 染色后光鏡下觀察腦組織缺血半暗帶神經(jīng)元細(xì)胞病理學(xué)改變及周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2.4 TTC 染色法測(cè)定腦梗死體積 每組取6 只麻醉處死后取腦放于零下20℃冰箱中冷凍30min 后，切成1.2mm 厚的腦片，迅速放于2%紅四氮唑(TTC)磷酸緩沖液中，避光37℃恒溫孵育30min。正常組織染為紅色，梗死組織為白色。10%的多聚甲醛溶液中固定24h 后拍照，應(yīng)用病理圖形分析儀測(cè)量腦梗死體積。根據(jù)公式V=t(A1+...An)－(A1+An)t/2 算出腦梗死體積和所染部分體積(其中t 為切片厚度，A 為梗死面積)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)缺陷評(píng)分

動(dòng)物麻醉后約2～3 h 清醒，假手術(shù)組動(dòng)物清醒后無(wú)明顯神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的癥狀和體征。其他各組動(dòng)物于清醒后出現(xiàn)反應(yīng)欠佳，活動(dòng)量及進(jìn)食明顯減少，左側(cè)前肢無(wú)力，提起尾時(shí)左前肢屈曲不能伸直，行走時(shí)左側(cè)偏斜或旋轉(zhuǎn)跌倒現(xiàn)象。與缺血再灌注模型組比較，大中劑量ROSI 治療組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 羅格列酮對(duì)大鼠腦梗死體積的影響

缺血再灌注后，假手術(shù)組大鼠腦組織未見(jiàn)梗死灶，模型組大鼠右側(cè)額頂葉和紋狀體可見(jiàn)較明顯的蒼白梗死灶。與假手術(shù)組相比，大中劑量組均可降低腦梗死體積P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

2.3 腦缺血再灌注后缺血半暗帶IL-18 表達(dá)

IL-18 在神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，光鏡下可見(jiàn)棕黃色顆粒沉積于細(xì)胞胞漿。假手術(shù)組檢測(cè)到極少量IL-18 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，模型組及小劑量干預(yù)組陽(yáng)性蛋白表達(dá)數(shù)量明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);與模型組相比，大中劑量干預(yù)組病灶處陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(見(jiàn)表3、圖1)。

2.4 病理組織學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察到假手術(shù)組腦組織HE 染色顯示結(jié)構(gòu)正常。模型組表現(xiàn)出典型腦梗死改變:梗死區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞核破裂分解、固縮壞死，細(xì)胞形態(tài)腫脹不規(guī)則，伴有白細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，ROSI 大中劑量治療組壞死灶相對(duì)較小，高倍鏡下可以觀察到腫脹壞死的細(xì)胞，但細(xì)胞減少程度較輕，壞死灶邊緣炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較(±s)

與模型組比較* P＜0.05

表2 各組大鼠缺血再灌注后腦梗死體積(mm3)

表3 各組大鼠缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)IL-18 表達(dá)的比較(±s)

表3 各組大鼠缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)IL-18 表達(dá)的比較(±s)

與假手術(shù)組比較▲P＜0.05;與模型組比較* P＜0.05

圖1 各組大鼠缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)IL-18 表達(dá)(IL-18×400)

3 討論

缺血再灌注引起的腦損傷機(jī)制包括多種因素，十分復(fù)雜，目前認(rèn)為其病理生理機(jī)制包括缺血后的代謝異常、能量耗竭與酸中毒、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎癥細(xì)胞因子損害、氧自由基損害、即早基因、熱休克蛋白基因表達(dá)以及缺血后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。其中，缺血再灌注后腦組織內(nèi)過(guò)度的炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的重要機(jī)制之一，而表達(dá)增加的炎癥因子更被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)［4］。因此有效阻斷炎癥反應(yīng)是治療缺血性腦血管疾病的一個(gè)重要策略。

炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注引起的繼發(fā)性損害中起著重要作用.再灌注時(shí)各種炎性因子激活炎性細(xì)胞，同時(shí)參與了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。IL-18 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)特性的細(xì)胞炎性因子。屬于IL-1 細(xì)胞因子家族成員，主要由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌，IL-18 具有多種生物學(xué)功能，能抑制保護(hù)因子IL-4和IL-10 的產(chǎn)生。上調(diào)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)的表達(dá)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的粘附和聚集，參與神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

還能促進(jìn)致炎因子的釋放，特別是具有誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ 的強(qiáng)大功能，增強(qiáng)Th1 型細(xì)胞反應(yīng)。此外，IL-18 還可以刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、GM-SF、和TNFα。外周血單核細(xì)胞在IL-18 刺激24h 后，可檢測(cè)到有IL-1 和IL-8 的產(chǎn)生，與Th1 型細(xì)胞反應(yīng)密切相關(guān)。有研究顯示，IL-18 與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，參與了腎臟、胃腸道缺血再灌注損傷［5，6］。國(guó)內(nèi)也有研究表明急性腦梗死患者血清IL-18 水平升高;血清IL-18 水平與腦梗死體積及臨床神經(jīng)功能缺損程度密切相關(guān)［7］。本研究證實(shí)，模型組缺血區(qū)腦組織IL-18 表達(dá)明顯增加，且壞死處白細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，表明炎癥反應(yīng)明顯參與腦梗死損傷的病理生理過(guò)程，進(jìn)一步印證了IL-18 及其介導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)參與缺血/再灌注腦損傷過(guò)程。

作為核轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ 主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中目的基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其功能。羅格列酮作為PPARγ 的特異性激動(dòng)劑，其抗炎作用逐漸引起了人們的重視。動(dòng)物缺血實(shí)驗(yàn)顯示，PPARγ 經(jīng)配體激活后可以抑制缺血導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、6、8 等細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)，減輕白細(xì)胞在缺血區(qū)的浸潤(rùn)，降低炎性細(xì)胞的毒性作用［8］。國(guó)外有研究表明，缺血再灌注后，ROSI 激活PPARγ 可以抑制IL-、TNF-α、IL-6 等誘導(dǎo)的IL-18 表達(dá)增加，還可以通過(guò)抑制caspase-1阻斷IL-18 的激活。此外，IL-18 誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ 是其主要生物學(xué)功能之一，PPARγ 激活后可以降低IFN-γ 的生物功能，使IFN-γ 激活的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞仍表現(xiàn)出靜止期的功能，并抑制iNO2mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶等炎性介質(zhì)mRNA 的表達(dá)［9，10］我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，與模型組比較，PPARγ 選擇性激動(dòng)劑羅格列酮2mg/kg、5mg/kg 可明顯改善神經(jīng)缺陷評(píng)分、梗死處組織病理學(xué)損傷，明顯縮小缺血再灌注后腦梗死體積，表明羅格列酮對(duì)再灌注后神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的其它噻唑烷二酮類藥物效應(yīng)相似［11］。應(yīng)用羅格列酮可明顯降低炎癥分子IL-18 表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，在大中劑量組表現(xiàn)更顯著，而小劑量組未見(jiàn)明顯差異，這表明羅格列酮對(duì)缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用可能與其抑制IL-18 的抗炎效應(yīng)有關(guān)，且可能具有劑量依賴性。

羅格列酮對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已引起越來(lái)越多的重視，我們的實(shí)驗(yàn)顯示了羅格列酮能夠減少腦梗死面積，改善預(yù)后，且其保護(hù)作用與抑制炎性介質(zhì)作用，減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。需要指出的是，缺血再灌注損傷是一個(gè)十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其機(jī)制往往是多方面的，因此，羅格列酮的保護(hù)作用可能與其他如抗凋亡、改善缺血后能量代謝、抗自由基、拮抗血小板活化因子、抗興奮性毒性等藥理作用相關(guān)聯(lián)，有關(guān)羅格列酮抗腦缺血再灌注損傷的確切分子作用機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。

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