趙雅寧，劉文倩，王紅陽，竇 娜，郭 霞，景麗偉

原花青素是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，屬于植物多酚類物質(zhì)，以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)、降血脂、抗腫瘤等功能［1～4］。目前有關(guān)葡萄籽原花青素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用研究較少。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep ap1nea-hypopnea syndrome，OSAHS)因睡眠過程反復(fù)發(fā)生的低氧/再復(fù)氧，可造成心、腦、腎等重要器官的損傷［5，6］。臨床上OSAHS患者表現(xiàn)警覺、執(zhí)行能力和運動協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知障礙，且與血管性癡呆的形成密切相關(guān)［6］。本研究采用在睡眠呼吸暫停模式慢性間歇性缺氧模型，探討葡萄籽原花青素對睡眠呼吸暫停模式低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬區(qū)磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和白介素-1β(IL-1β)表達(dá)的影響，為中藥的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 雄性SD 大鼠80只(北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003)，體質(zhì)量310～350g;H-7650 透射電鏡(日本日立公司);測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠);低氧控制程序(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科);純氮(天津六方氣體高科技有限公司);低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué)研制)。

1.2 動物分組和模型制備 80 只雄性SD 大鼠隨機分成對照組、模型組及高、低劑量葡萄籽原花青素干預(yù)組，各組動物20 只。模型組:模擬臨床臨床呼吸暫停事件，建立OSAHS 模式間歇低氧動物模型:每天8:00Am～4:00Pm 將實驗動物置于模型艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣和空氣，每組每次循環(huán)2min，連續(xù)給予氮氣30s，維持艙內(nèi)氧濃度最低至5%(50ml/L)，隨后均復(fù)氧至氧濃度21%(210ml/L)。對照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi)，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內(nèi);每天實驗8h，實驗持續(xù)時間為2 和6w。干預(yù)組在動物進(jìn)入低氧模型艙前2w 開始每天灌胃給藥1 次，持續(xù)給藥8w，劑量分別為:高GSP200mg/kg、低100mg/kg。分別在實驗2w 和6w 進(jìn)行所設(shè)指標(biāo)檢測。

1.3 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(電鏡)常規(guī)麻醉動物，開胸、暴露心臟，用混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，斷頭取腦，取大腦海馬組織，切成1mm×1mm×1mm 組織塊，立即以40ml/L 戊二醛固定，0.1mol/L 二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，再經(jīng)40ml/L 四氧化鋨固定，緩沖液沖洗，逐級丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透，包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.4 磷酸化P38MAPK 和IL-1β 蛋白質(zhì)印跡檢測 大鼠致死后，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量0.6g，4℃PBS 充分洗滌，加入3 倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5min，12000 r/min，取上清。考馬斯亮藍(lán)(南京建成生物有限公司)法測各樣本的蛋白含量，樣本貯存于－80℃?zhèn)溆?。檢測步驟:蛋白樣品40μg 與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10min，100g/L 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩2～3h，加入抗體(美國Cell Signaling 公司，磷酸化P38MAPK和IL-1β 濃度均為1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST 洗膜，標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，TBST 洗膜，ECL 顯色，用圖像分析儀測定光密度，作定量分析。

1.5 學(xué)習(xí)記憶功能檢測 按照Smith 等［7］的方法，采用Morris 水迷宮進(jìn)行檢測。每只動物晨起訓(xùn)練5 次后分別在上午、下午各測試6 次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間單位為秒(s);及撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數(shù)，取檢測記錄的總均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢驗方法為組間分析采用析因設(shè)計資料的方差分析，組內(nèi)分析采用SNK-q 分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，P＜0.05 為有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 對照組神經(jīng)細(xì)胞形狀規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，胞核形狀規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)均勻，電子透明度高。模型組細(xì)胞外形不規(guī)則，多數(shù)線粒體嵴斷裂、減少、甚至出現(xiàn)大量空泡、消失或難以辨認(rèn)，染色質(zhì)聚集靠邊等;葡萄籽原花青素組神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)減輕，高劑量組尤為明顯(見圖1～圖5)。

2.2 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表達(dá)變化 免疫印跡法檢磷酸化p38MAPK 和IL-1β蛋白表達(dá)水平:以β-actin 校準(zhǔn)后的蛋白條帶IOD 值反映其蛋白水平。與對照組比較，模型組腦組織海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表達(dá)增高，且隨低氧時間時間的延長，磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平進(jìn)一步增高;與間模型組比較，葡萄籽原花青素可有效降低磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平，且在高劑量葡萄籽原花青素組減低更為顯著(見表1)。

2.3 各組水迷宮檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組動物的大鼠逃避潛伏期時間均延長、穿越原平臺位置的次數(shù)均減少;與模型組比較，葡萄籽原花青素組能顯著縮短大鼠逃避潛伏期時間、增加原平臺位置的次數(shù)(P＜0.05)(見表2)。

表1 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比較(±s)

表1 各組海馬區(qū)磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比較(±s)

與對照組比較* P＜0.05;與模型組比較△P＜0.05;與低劑量組比較▲P＜0.05

表2 各組動物水迷宮檢測結(jié)果的比較(±s)

表2 各組動物水迷宮檢測結(jié)果的比較(±s)

與對照組比較* P＜0.05;與模型組比較△P＜0.05;與低劑量組比較▲P＜0.05

圖1 對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

圖2 模型組2w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

圖3 模型組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

圖4 低劑量組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

圖5 高劑量組6w 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(電鏡×20000)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可減輕OSAHS 模式間歇性低氧大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)損傷，改善動物學(xué)習(xí)記憶功能，說明葡萄籽原花青素對OSAHS導(dǎo)致的神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用。OSAHS 特征性的低氧方式是慢性間歇低氧，這種缺氧-復(fù)氧方式對神經(jīng)的損傷現(xiàn)類似腦缺血/再灌注，產(chǎn)生大量的活性氧，引起腦內(nèi)強烈氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，學(xué)習(xí)記憶受損［8］，因此給予具有較強抗氧化、清除自由基作用的葡萄籽原花青素對OSAHS 誘導(dǎo)神經(jīng)損傷有較好保護(hù)作。譚毓治［9］曾報道葡萄籽原花青素能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，與其能降低血液和腦組織中過氧化脂質(zhì)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可抑制OSAHS 模式間歇性低氧大鼠腦內(nèi)p38MAPK 的活性和炎癥因子IL-1β 的表達(dá)。p38MAPK 是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員，其活化對學(xué)習(xí)記憶的影響主要表現(xiàn)負(fù)性作用。研究顯示p38MAP 活化后經(jīng)多級激酶反應(yīng)介導(dǎo)凋亡基因或蛋白表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，學(xué)習(xí)記憶損傷［10］;此外，p38MAP 活化直接對海馬神經(jīng)突觸可塑性產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致長時程增強(LTP)的受損從而致空間學(xué)習(xí)能力受損［11］。炎癥因子IL-1β 可通過核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κ B)激活巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞分泌粘附因子、IL-6、IL-8 等產(chǎn)生，促進(jìn)腦缺血缺氧后腦組織炎癥損傷的加劇，神經(jīng)功能受損。此外，IL-1β 可影響腦細(xì)胞對神經(jīng)活性物質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放和再攝取、調(diào)控輸入與輸出關(guān)系的反應(yīng)環(huán)路、影響突觸的可塑性和LTP 等，在認(rèn)知功能方面具有重要作用［12，13］。本研究中給予葡萄籽原花青素干預(yù)后，動物學(xué)習(xí)記憶明顯改善，同時二者表達(dá)水平呈劑量依賴式顯著下降，說明葡萄籽原花青素通過抑制p38MAPK 信號活化、減少IL-1β表達(dá)而改善OSAHS 模式低氧大鼠的認(rèn)知行為。

總之，本實驗結(jié)果表明葡萄籽原花青素可以通過降低腦組織海馬區(qū)p38MAPK 信號活化、減少IL-1β 表達(dá)，而改OSAHS 模式低氧導(dǎo)致的動物認(rèn)知功能損傷。葡萄籽原花青素具有多種藥理活性，其改善OSAHS 神經(jīng)損傷的其它機制有待進(jìn)一步探討。

［1］吳秀香，張 妍，刊柳青，等.葡萄籽原花青素對腎血管性高血壓犬鼠血管重塑的影響［J］.中國病理生理，2012，28(6)1023－1027.

［2］Cui XP，Li BY，Gac HQ，et al.Effects of grape seed proanthoeyanidin extracts on peripheral nerves in streptozocin-induced diabetic rats［J］.Nutr Sci Vitaminol(Tokyo)，2008，54(4):321－328.

［3］Hsu CP，Lin YH，Chou CC，el al.Mechanisms of grape seed proeyanidin-induced apoptosis in colorectal carcinoma cells［J］.Anticancer Res，2009，29(1):283－289.

［4］Feng Y，Liu YM，Leblanc MH，et al.Grape seed extract given three hours after injury suppresses lipid peroxidation and reduces hypoxicischemic brain injury in neonatal rats［J］.Pediatr Res，2007，61(3):295－300.

［5］McNicholas WT，Bonsignore MR.Management Committee of EU COST ACTION B26.Sleep apnea as an independent risk factor for cardiovascular disease:current evidence，basic mechanic isms and research priorities［J］.Eur Respir，2007，29(1):156－178.

［6］李 浩，吳 敏，姚明江，等.老年輕度認(rèn)知功能障礙與氧自由基代謝、乙酰膽堿酯酶、血脂及炎性介質(zhì)的關(guān)系［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2008，21(3):201－204.

［7］Smith DH，Okiyama K，Thomas MJ，et al.Evaluation of memory dysfunction following experimental brain injury using the Morris water maze［J］.Neurotrauma，1991，8(4):259－269.

［8］王紅陽，韓曉慶，張盼盼，等.重度間歇低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶功能與氧化應(yīng)激的關(guān)系［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(1):34－36.

［9］譚毓治，萬曉霞，賴娟娟，等.葡萄籽原花青素對學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.中國藥理通學(xué)報，2004，4(7):804－807.

［10］趙雅寧，陳桂芝，陳長香，等.P38MAPK 信號通路對睡眠剝奪大鼠認(rèn)知功能損害的機制研究［J］.解剖學(xué)報，2011，42(1):32－37.

［11］袁 輝，楊 勝，周文霞，等.MAPK 級聯(lián)信號通路與長時程增強［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(7):769－774.

［12］Spaccapelo L，Bitto A，Galantucci M，et al.Melanocortin MC receptor agonists counteract late inflammatory and apoptotic responses and improve neuronal functionality after cerebral ischemia［J］.Eur Phamacology，2011，670(2－3):479－486.

［13］Majde JA，Krueger JM.Links between the innate immunesystem and sleep［J］.Allergy Clin Immunol，2005，116(6):1188－1198.