稀有人參皂苷compound K轉(zhuǎn)化菌株的篩選及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

趙雪淞，孟 月，陳星星

(1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)學(xué)院，遼寧阜新123000; 2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130024)

人參皂苷compound K(C－K)屬于原人參二醇型皂苷，在人參花和果中存在，但含量甚微［1］;在人體腸道內(nèi)，腸道細菌可將其他的原人參二醇型皂苷降解為人參皂苷C－K［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，稀有人參皂苷C－K具有抗腫瘤、抗突變、抗衰老、防過敏、抗炎保肝、抗糖尿病等廣泛的生物活性，具有顯著的藥用價值［3－8］。因此，如何獲得大量的稀有人參皂苷C－K成為現(xiàn)代藥學(xué)研究的重點。在結(jié)構(gòu)上，稀有人參皂苷C－K與人參中含量較多的原人參二醇型皂苷如Rb1、Rb2、Rc等相比，僅僅是在糖基側(cè)鏈上有所不同(圖1)。因此，可以通過對高含量的人參皂苷進行結(jié)構(gòu)改造的方法來制備稀有人參皂苷C－K。人參皂苷結(jié)構(gòu)改造的方法主要有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)法雖然操作上較簡單，但是專一性差、副產(chǎn)物多，且轉(zhuǎn)化效率低。與化學(xué)法相比，生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、得率高等優(yōu)點，是目前獲得稀有人參皂苷的最有效途徑［9］。近年來，生物轉(zhuǎn)化法制備稀有人參皂苷C－K取得了一些進展［10－14］。但是，篩選出成本低、專一性高的優(yōu)良菌種或菌株仍然是制備稀有人參皂苷C－K的關(guān)鍵因素。許多植物病原真菌可以分泌糖苷水解酶，用于水解寄主的細胞壁或者寄主產(chǎn)生的糖苷類物質(zhì)，并且，植物病原真菌具有繁殖快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，是篩選轉(zhuǎn)化菌株的良好來源。本文從22種植物病原真菌中篩選出一種可以高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為稀有人參皂苷C－K的真菌，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。研究結(jié)果為人參皂苷C－K的工業(yè)制備奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

22種植物病原真菌 采自長春市郊茄科植物病原組織;V8汁培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含有200mL V8汁、2g CaCO3和15g瓊脂)、4℃暗保存;人參皂苷標準品Rb1、Rb2、Rc、Rd和C－K 成都曼斯特生物技術(shù)有限公司;人參皂苷混合物及人參皂苷單體 本實驗室制備并采用HPLC(與標準品比較)和13C－NMR鑒定。具體制備方法如下:五年生人參干燥根(吉林撫松產(chǎn))水煮法提取人參總皂苷，醇沉除去大部分人參多糖雜質(zhì)，上清經(jīng)大孔吸附樹脂和硅膠柱層析分離得到二醇型和三醇型人參皂苷混合物，混合物再經(jīng)HPLC分離純化得到人參皂苷單體。人參皂苷單體的純度均達到95%以上。葡萄糖、氯仿、甲醇、乙醇、正丁醇等化學(xué)試劑 北京化工廠;瓊脂 上海生物技術(shù)有限公司;硅膠G薄層層析板(0.25～0.3mm) 青島海洋化工廠。

圖1 原人參二醇型皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of protopanaxadiol type saponins

BCN－136OB型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;DHG－9075A型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司;Z－36HK型低溫高速離心機 德國Hermle公司;YXQ－LG型全自動立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司;恒溫空氣浴震蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;IX71倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;VORTEX－5型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 分析方法

TLC分析采用 G60硅膠板，展開劑:CHCl3－MeOH－H2O(65∶35∶10或70∶30∶10，v/v/v，下層)。顯色劑:5%硫酸乙醇，105℃加熱5min。展開方式:上行展開。

1.3 人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化

供試菌種置于V8汁液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，130r/min、28℃，培養(yǎng)8d后，紗布過濾和離心，8000×g、4℃、離心20min，棄去上清，得到孢子。將孢子懸浮在20mmol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中，在130r/min、28℃條件下震蕩培養(yǎng)24h，然后加入人參皂苷儲備液(人參皂苷樣品溶于pH5.0 20mmol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液中并通過0.2μm的濾膜過濾除菌)，使孢子的終濃度為5×106個/mL，底物的終濃度為0.25mg/mL，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)0～10d。從加入人參皂苷的0h開始取樣，每隔24h取樣一次，加入等體積的正丁醇萃取，上層正丁醇相減壓蒸干，重新溶于40%乙腈水溶液中，TLC檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。

1.4 植物病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌種活化后接入PDA固體培養(yǎng)基，用劃“Z”線的方法接種。然后將滅過菌的蓋玻片以45度角垂直于Z線插入，28℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài);然后小心取下蓋玻片，制作臨時裝片，在顯微鏡下觀察真菌菌絲和孢子的特征。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化菌株的篩選

因為分離純化得到人參皂苷單體的成本較高，此步實驗采用原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和少量Rd的混合物為底物，從22種植物病原真菌中篩選稀有人參皂苷C－K的轉(zhuǎn)化菌株。結(jié)果表明，22種植物病原真菌中有6種真菌能將底物轉(zhuǎn)化到C－K (圖2)。從TLC圖譜上可以看出，1.91和1.26號真菌轉(zhuǎn)化速率相對較快，在15d時，底物幾乎完全轉(zhuǎn)化，而用1.91號真菌轉(zhuǎn)化，C－K的產(chǎn)率最高，中間產(chǎn)物的產(chǎn)量最低。根據(jù)上述結(jié)果，選擇1.91號真菌作為稀有人參皂苷C－K的轉(zhuǎn)化菌株，對其做進一步研究。

圖2 TLC分析6種真菌對原人參二醇型皂苷混合物的轉(zhuǎn)化Fig.2 TLC analysis of the biotransformation of the mixture of protopanaxadiol type saponins by 6 fungi

2.2 1.91號植物病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)1.91號真菌，菌落為圓形，顏色初為白色，之后轉(zhuǎn)為淺綠色，最后轉(zhuǎn)為墨綠色接近黑色;培養(yǎng)基反面成黑色;菌落扁平，無滲出液。顯微鏡下觀察(圖3)，菌絲呈樹枝狀，透明，有隔，分生孢子串生于孢子梗頂端，無色，無隔膜，兩端平切，未發(fā)現(xiàn)明顯的子囊果。根據(jù)上述菌落、菌絲及孢子的形態(tài)特征，查閱真菌鑒定手冊［15］，初步鑒定1.91號真菌屬于半知菌類叢梗孢目叢梗孢科卵形孢霉屬(Oospora Wallr.)。

圖3 1.91號菌株的菌絲和孢子形態(tài)Fig.3 The shapes of colony(A) and hyphae(B)of strain sp.1.91

2.3 1.91號真菌轉(zhuǎn)化原人參二醇型皂苷的轉(zhuǎn)化途徑

在上述的篩菌實驗中，由于底物較復(fù)雜，產(chǎn)物較多，從TLC圖譜上，只能初步判斷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，不能確定具體的轉(zhuǎn)化途徑，因此采用原人參二醇型人參皂苷單體Rb1和Rb2進一步研究卵形孢霉對人參皂苷的轉(zhuǎn)化途徑。

2.3.1 1.91號真菌對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化 1.91號真菌對人參皂苷單體Rb1的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖4所示。通過TLC圖可以看出，1.91號真菌對Rb1單體的轉(zhuǎn)化非常迅速，在0h(此處所指的0h并非絕對0h，它包含取樣和正丁醇萃取的時間)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成產(chǎn)物1;1d的時候底物Rb1和產(chǎn)物1完全消失，生成大量的產(chǎn)物2和少量產(chǎn)物3;8d時只剩產(chǎn)物3。通過對比產(chǎn)物與標準品的Rf值，可知:產(chǎn)物1為人參皂苷Rd，產(chǎn)物2為人參皂苷F2，產(chǎn)物3為人參皂苷C－K。由此可以確定1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的途徑為:Rb1→Rd→F2→C－K。

圖4 TLC分析1.91號菌株對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化Fig.4 TLC Analysis of the biotransformation of ginsensodies Rb1by strain sp.1.91

2.3.2 1.91號真菌對人參皂苷Rb2的轉(zhuǎn)化 1.91號真菌對人參皂苷Rb2的轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖5。從TLC圖中可以看出:5d的時候底物Rb2被完全轉(zhuǎn)化，生成產(chǎn)物1和少量的產(chǎn)物2;隨著時間的延長，產(chǎn)物2的量逐漸增加，直到第10d，沒有產(chǎn)物C－K出現(xiàn)。產(chǎn)物1的Rf值略高于標樣Rd，產(chǎn)物2的Rf值略高于標樣F2，據(jù)此推測，產(chǎn)物1可能為人參皂苷C－O，產(chǎn)物2可能為人參皂苷C－Y，1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2的途徑可能為Rb2→C－O→C－Y，沒有C－K生成。原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2和Rc具有共同的苷元(原人參二醇)和C－3位的糖鏈(Glc β－(1，2)－Glc)，不同之處在于C－20位的糖鏈。Rb1的C－20位是二個葡萄糖以β(1→6)糖苷鍵相連接，Rb2的C－20位是一個吡喃型阿拉伯糖和一個葡萄糖以α(1→6)糖苷鍵相連接，Rc的C－20位是一個呋喃型阿拉伯糖和一個葡萄糖以α－(1→6)糖苷鍵相連接(圖1)。因此，上述研究結(jié)果說明，1.91號真菌分泌的糖苷酶是一種葡萄糖苷酶，對葡萄糖苷鍵具有特異性，不水解阿拉伯糖苷鍵，所以Rb2轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中沒有C－K生成。據(jù)此推測，1.91號真菌對人參皂苷Rc的轉(zhuǎn)化也不會有大量C－K生成，稀有人參皂苷C－K主要由人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化而來。為了更好地應(yīng)用1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1來制備稀有人參皂苷C－K，我們進一步以人參皂苷Rb1為底物，優(yōu)化1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化條件。

圖5 TLC分析1.91號菌株對人參皂苷Rb2的轉(zhuǎn)化Fig.5 TLC Analysis of the biotransformation of ginsensodies Rb2by strain sp.1.91

2.4 1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的條件優(yōu)化

2.4.1 底物添加時間對轉(zhuǎn)化的影響 卵形孢霉的孢子在28℃、130r/min條件下預(yù)培養(yǎng)12、24、48、72h后分別加入Rb1溶液，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6d，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖6。從TLC圖中可以看出:孢子預(yù)培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)化Rb16d，產(chǎn)物完全是C－K，效率最高;而孢子預(yù)培養(yǎng)24、48、72h后轉(zhuǎn)化Rb16d，仍有一定量的F2存在。因此，孢子預(yù)培養(yǎng)12h是最佳的底物添加時間。

2.4.2 pH對轉(zhuǎn)化的影響 在pH2.0－8.0的緩沖液中，用1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1，培養(yǎng)時間為4d，結(jié)果如圖7。從TLC圖中可以看出:在pH5.0～6.0的緩沖液中，轉(zhuǎn)化效率最高，底物全部轉(zhuǎn)化，生成唯一終產(chǎn)物C－K。所以，1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的最適pH是pH5.0～6.0。

2.4.3 溫度對轉(zhuǎn)化的影響 在28、37、45、55℃的溫度下，用1.91號真菌對人參皂苷Rb1進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果如8所示。從TLC圖可以看出，轉(zhuǎn)化4d時，45℃條件下，Rb1的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物幾乎完全是C－K，而28、37、55℃條件下，產(chǎn)物為F2和C－K;轉(zhuǎn)化10d時，在28、37、55℃的轉(zhuǎn)化條件下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物仍是F2和C－K，沒有完全轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物C－K。所以，卵形孢霉轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的最適溫度為45℃。

圖6 底物添加時間對1.91號菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.6 Effect of the time of substrate addition on biotransformation of ginsensodies Rb1by strain sp.1.91

圖7 pH對1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.7 Effect of pH on biotransformation of ginsensodies Rb1by strain sp.1.91

圖8 溫度對1.91號菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的影響Fig.8 Effect of temperature on biotransformation of ginsensodies Rb1by strain sp.1.91

3 結(jié)論

以原人參二醇型皂苷混合物為底物篩選22種植物病原真菌，結(jié)果有6種真菌能夠轉(zhuǎn)化底物為稀有人參皂苷C－K，其中1.91號真菌的轉(zhuǎn)化效率最高。通過初步形態(tài)學(xué)鑒定，該真菌屬于半知菌類叢梗孢目叢梗孢科卵形孢霉屬(Oospora Wallr.)真菌。1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的途徑為:Rb1→Rd→F2→C－K;轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb2的途徑為:Rb2→C－O→C－Y。這一結(jié)果說明，1.91號真菌分泌的糖苷酶是一種葡萄糖苷酶，對葡萄糖苷鍵具有特異性，所以稀有人參皂苷C－K主要由人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化而來。1.91號真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為C－K的最佳條件為:最佳底物添加時間是孢子預(yù)培養(yǎng)12h后;轉(zhuǎn)化最適pH是pH5.0－6.0;轉(zhuǎn)化最適溫度是45℃。本文為人參皂苷C－K的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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