蕎麥芽提取物抗突變和抑制腫瘤作用的實驗研究

孫國娟，李善姬，崔泰花，崔承弼，*

(1.延邊大學醫(yī)學院，吉林延吉133002;2.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生院，吉林132013;3.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉133002)

蕎麥為蓼科蕎麥屬雙子葉禾谷類植物，是一種重要的雜糧作物，我國廣泛種植的品種主要有甜蕎和苦蕎兩種［1］。近年來醫(yī)學、農(nóng)業(yè)及食品營養(yǎng)學等方面的研究不斷表明［2］，蕎麥的營養(yǎng)價值位居所有糧食作物之首，因其豐富的營養(yǎng)成分，以及較高的營養(yǎng)價值，素有“五谷之王”的美譽。同時蕎麥還含有其他禾谷類糧食作物所沒有的葉綠素和類黃酮物質(zhì)，特別是蘆丁的含量很高。蘆丁有軟化血管，降低血糖，調(diào)節(jié)血壓，降低血清膽固醇的作用，同時對預(yù)防和治療高血壓、心腦血管疾病等均有一定的藥理作用［3］。最近已有研究報道，蕎麥具有抗突變和抗腫瘤的作用，但對蕎麥芽的一些保健功能仍需進一步研究和開發(fā)。本實驗以蕎麥芽為研究對象，以小鼠骨髓細胞微核和小鼠S－180移植性腫瘤為觀察指標，對蕎麥芽提取物的抗突變和抑制腫瘤的藥效作用進行了研究，為蕎麥資源的深度開發(fā)與利用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥 山西省農(nóng)科院小雜糧研究中心提供;實驗動物 SPF級 Balb/c、ICR小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由延邊大學實驗動物中心提供;小鼠S－180肉瘤細胞株 由中國藥科大學抗腫瘤藥物實驗室提供;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;Giemsa色素 天津博迪化工有限公司;N－甲基－N－硝基－N－亞硝基胍(MNNG) 日本和光純藥有限公司;甲醇、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等 均為分析純。

FW－200型高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;JA10003N型電子天平 民橋精密科學儀器有限公司;HH－S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器廠;MCO－5AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;XDS1D型倒置顯微鏡 上海萬衡精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕎麥芽提取物的制備 麥芽(長度12～16cm，下胚軸厚度約1.8～1.9cm)用粉碎機粉碎成粉末，然后添加樣品重量10倍的70%乙醇浸泡，在80℃的條件下，每浸泡8h提取一次，共提取3次。合并3次提取液，用減壓過濾裝置進行熱態(tài)過濾后，再減壓濃縮回收乙醇提取物。取部分提取物加適量水溶解后，根據(jù)溶劑不同的極性，依次用2～3倍正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5種溶劑進行萃取，收集各萃取液，包括母液共得到6個不同極性的粗體部位。最后減壓濃縮，進行凍結(jié)干燥，保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核實驗 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2d，無異常后開始實驗，選用健康狀況良好體重18～25g的ICR小鼠每組10只，雌雄各半。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置蕎麥芽苗乙醇提取物及各萃取物溶液10、20、40、80mg/kg 4 個劑量組及陰性對照組(蒸餾水)和致突變物對照組(MNNG 150mg/kg)，按0.2mL/25g灌胃給藥，連續(xù)7d，對照組同時以蒸餾水灌胃。實驗?zāi)┢?最后2d)，給藥組及致突變物對照組給予致突變物MNNG 2次，給藥時間間隔24h，最后一次給藥后6h將各實驗組動物頸椎脫臼處死，取兩腿股骨，剔除肌肉，用紗布擦除碎肉和血污，剪去股骨兩端的骨骺后，將吸取適量小牛血清帶針頭的2mL注射器插入骨髓腔內(nèi)，使骨髓迅速沖入到離心管中，然后待骨髓團塊與小牛血清混合均勻后，在離心機內(nèi)離心10min(1000r/min)，棄掉多余的上清液，留下約0.5mL上清液與沉淀物混和均勻后，用滴管吸取適量，滴在清潔的載玻片上進行涂片，長度約為2～3cm，在空氣中晾干。將已干燥的涂片在甲醇中固定15min左右，然后在Giemsa應(yīng)用液中染色15min后立即用pH6.8磷酸緩沖液沖洗，陰涼干燥處保存。在油鏡下選擇細胞分散好、形態(tài)完整、染色良好的部位，按一定順序進行計數(shù)。油鏡下觀察1000個嗜多染紅細胞(PCE)中微核(MN)出現(xiàn)的千分率［5－7］。

1.2.3 小鼠 S－180肉瘤細胞株實驗 選擇培養(yǎng)7～10d的生長良好的瘤株，無菌取腹腔積液，用0.9%無菌生理鹽水按1∶3稀釋成瘤細胞懸液，并計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL，用體重18～20g的Balb/c小鼠42只，每只0.2mL接種至小鼠右側(cè)腋窩下。24h后選擇一般狀態(tài)良好的小鼠，稱重后隨機分為7組:空白對照組、乙醇提取物組、正己烷提取物組、氯仿提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組及水提取物組。每組6只，各組溶液灌胃給藥，給藥劑量為0.5mg/kg·d，連續(xù)給藥20d，空白對照組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液，停藥次日處死動物。解剖剝離瘤塊，稱瘤重，計算腫瘤生長抑制率［8－10］。

腫瘤抑制率(%)=空白對照組平均瘤重－實驗組平均瘤重/空白對照組平均瘤重×100

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS10.0中相應(yīng)程序?qū)?shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，各實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析進行檢驗，p＜0.05為顯著性檢驗標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥芽提取物對小鼠骨髓細胞微核的抑制作用

蕎麥芽提取物對小鼠骨髓細胞微核的作用結(jié)果如表1所示，陰性對照組小鼠的骨髓微核率最低，陽性對照組與蕎麥芽提取物4個劑量組的微核率均顯著高于陰性對照組(p＜0.05)。而不同劑量的蕎麥芽各提取物組與陽性對照組相比微核率顯著下降(p＜0.05)。并且各提取物組隨著濃度的增高，微核率逐漸降低，抑制率的效果逐漸增強。其中蕎麥芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg濃度下，對小鼠骨髓微核的作用效果最好，抑制率達73.4%、75.8%、74.2%。蕎麥芽提取物對MNNG誘發(fā)的小鼠骨髓細胞微核的發(fā)生有明顯的抑制效果。

表1 蕎麥芽提取物對小鼠骨髓細胞微核的抑制作用Table 1 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on bone marrow cells of mice

2.2 蕎麥芽提取物對小鼠S－180肉瘤生長的抑制作用

蕎麥芽提取物對小鼠S－180肉瘤生長的抑制作用見表2。由表2可以看出，各成分處理組小鼠平均瘤重低于對照組，各活性成分對肉瘤均有一定的抑制作用。其中，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對小鼠S－180肉瘤的生長有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為39.5%、38.0%，與空白對照組比較有顯著差異(p＜0.05)。

表2 蕎麥芽提取物對小鼠S－180肉瘤生長的抑制作用Table 2 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on tumor bearing Balb/c mouse

3 討論

3.1 微核與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期遺留在細胞質(zhì)中，末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，包含在子細胞的胞質(zhì)中，比主核小，大小相當于細胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，故稱微核［11］。骨髓細胞微核分析是檢測化學品對嗜多染紅細胞干細胞所產(chǎn)生的致染色體畸變作用，因其快速、簡便的特點很快成為廣泛使用的遺傳毒理學實驗方法之一。國際組織也將其規(guī)定為評價食品添加劑、農(nóng)藥、新藥等化合物的安全性必做實驗之一［12］。而且，此法節(jié)省了在處理細胞群中尋找中期相的時間，同時也比分析染色體畸變要方便一些。但是該實驗也受到許多因素的影響，例如小鼠品系、劑量、給藥次數(shù)、給藥途徑、取材部位等。因此，骨髓細胞微核分析方法有待于進一步的研究與探討。

3.2 惡性腫瘤是目前危害人們生命和健康的惡性疾病之一，2010年癌癥已經(jīng)超越心、腦血管疾病成為21世紀人類的第一殺手，同時也成為全球最大的公共衛(wèi)生問題之一。因此，尋找癌癥的預(yù)防與治療方法受到國際科學工作者的普遍關(guān)注和高度重視［13］。而化合物合成的抗癌藥對人體正常細胞可能產(chǎn)生毒副作用，因此從天然動、植物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分仍是近年來國內(nèi)外科學工作者研究的熱點之一［14］。蕎麥作為藥食兩用植物，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、不飽和脂肪酸，而且含有其它糧食作物所沒有的黃酮類化合物，而黃酮類化合物在抗腫瘤方面的作用是目前研究的熱點之一，其抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等方面［15］。所以本實驗對蕎麥芽提取物對小鼠S－180肉瘤生長的抑制作用進行研究，結(jié)果蕎麥芽提取物具有一定的抗腫瘤活性，我國具有豐富的蕎麥資源，蕎麥芽具有抗腫瘤作用的研究成果將有利于促進蕎麥資源的深度開發(fā)與利用，將為保健食品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

4.1 在小鼠骨髓細胞微核實驗中，蕎麥芽提取物對誘導(dǎo)物MNNG導(dǎo)致的染色體損傷具有保護作用，其中蕎麥芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg濃度下，對小鼠骨髓微核的作用效果較好，抑制率達73.4%、75.8%、74.2%。

4.2 在腫瘤的抑制實驗中，蕎麥芽提取物對小鼠S－180肉瘤細胞移植性腫瘤均有抑制效果。其中乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對小鼠S－180肉瘤的生長抑制作用最為明顯，抑瘤率分別為39.5%、38.0%。

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