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      NNK和B[a]P在卷煙煙氣復(fù)雜基質(zhì)中的聯(lián)合遺傳毒性

      2013-03-14 07:11:30木瀠朱茂祥潘秀頡楊陟華齊紹武
      中國煙草學(xué)報 2013年1期
      關(guān)鍵詞:核率微核卷煙

      木瀠,朱茂祥,潘秀頡,楊陟華,齊紹武

      1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草工程技術(shù)研究中心,長沙410128;2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850

      近年來,卷煙安全性問題受到日益顯著的重視。卷煙煙氣是由數(shù)千種化合物組成的一種混合物[1]。卷煙煙氣具細胞毒性、遺傳毒性及誘變性,這些化合物之間的相互作用會影響單一物質(zhì)對卷煙煙氣毒性的貢獻。謝劍平等[2]研究發(fā)現(xiàn):在卷煙煙氣眾多有害成分中,對卷煙主流煙氣危害性影響最大的7項有害成分指標(biāo)為∶ CO、HCN、NH3、甲基亞硝胺吡啶基丁酮(NNK)、苯并[a]芘(B[a]P)、苯酚、巴豆醛。當(dāng)前常規(guī)卷煙安全性評價的方法最常用的是對焦油、一氧化碳和煙氣煙堿三項指標(biāo)的評價[3],很少涉及到卷煙煙氣有害物之間的相互作用關(guān)系、煙氣吸入后對人體的毒性作用及其作用機制等問題的研究, 這顯然是不全面的。相關(guān)研究表明[4-9],卷煙煙氣和煙氣冷凝物均可以導(dǎo)致細胞微核的出現(xiàn)。卷煙煙氣冷凝物可以導(dǎo)致培養(yǎng)的哺乳動物細胞出現(xiàn)染色體畸變[10-14]。微核試驗作為推斷化合物染色體損傷的遺傳毒性檢測方法,具有快速、簡便、經(jīng)濟等特點,在環(huán)境化合物快速篩選和大量職業(yè)暴露人群檢測方面得到廣泛應(yīng)用。微核檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性優(yōu)于其它染色體畸變分析,因此許多國家和國際組織將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學(xué)安全性評價的必做實驗[15]。微核檢測方法主要集中于鏡檢法(常規(guī)微核試驗、胞質(zhì)分裂阻滯法、熒光原位雜交試驗與DNA 探針、抗著絲??贵w染色)和自動化法(圖像分析系統(tǒng)檢測和流式細胞儀檢測)[16]。

      B[a]P、NNK為兩種卷煙煙氣重要代表有害物,具一定的致癌性[17-18],已成為近年來有關(guān)煙草致癌研究的熱點,卷煙主流煙氣化學(xué)成分中B[a]P、NNK的含量情況如下表1所示[2]。筆者以肯塔基參比卷煙3R4F為研究對象,以B[a]P、NNK為目標(biāo)化合物,采用廣泛應(yīng)用于細胞誘變性試驗的鏡檢微核法[19],結(jié)合三者對人體支氣管上皮細胞的毒性作用,分析B[a]P、NNK在卷煙煙氣復(fù)雜基質(zhì)中的聯(lián)合作用,以期為卷煙煙氣的安全性評價提供參考。

      表1 163種不同類型卷煙樣品中NNK和B[a]P成分比較[2]

      1 材料與方法

      1.1 材料

      肯塔基參比卷煙3R4F(美國肯塔基大學(xué));LHC-8培養(yǎng)液( Biofluids Inc公司);胰蛋白酶、B[a]P (純度≥96%,Sigma公司);NNK (純度≥99.0%,Alfar Aesar公司);細胞松弛素B(Applichem公司);DAPI(羅氏試劑);甲醇溶液;潔凈工作臺(北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司);TS100倒置顯微鏡(Nikon公司 );BB15型 CO2孵 箱 (Thermo公 司 );Milli-Q50超純水儀(Millipore公司);JJ100型單通道吸煙機(中國煙草總公司鄭州煙草研究院)。

      1.2 細胞培養(yǎng)

      腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支氣管上皮細胞(BEAS-2B),用無血清的LHC-8培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2和95%濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19]。

      1.3 卷煙煙氣凝聚物(CSC)的制備

      設(shè)定抽煙機抽吸周期為 60 s、抽吸長度為 2 s,抽吸容量為 30 mL。連接密封的兩個玻璃氣體采樣收集器,第一個收集器內(nèi)裝有 5.0 mL 95%的乙醇,另一個收集器內(nèi)裝有 5.0 mL 雙蒸水,用打火機點燃卷煙樣品,將燃燒產(chǎn)生的煙氣通過橡皮導(dǎo)管通入氣體收集管,依照早已設(shè)定的抽吸速率,連續(xù)不停地收集10 支卷煙抽吸產(chǎn)生的煙氣于收集器內(nèi)。等最后一支抽吸完后,將兩個收集器中的液體充分混勻,定容至10.0 mL 容量瓶中搖勻,分裝在 0.5 mL EP管中用封口膜封口,后放入液氮罐中儲藏備用。卷煙煙氣冷凝物CSC的濃度為10mg/mL[20]。

      1.4 實驗方法

      1.4.1 微核試驗方法

      筆者先采用細胞毒性測試檢測出三種受試物的IC50[20]。收集處于指數(shù)生長期的BEAS-2B細胞,制成細胞懸液(1.4×105個/mL),接種于35×10mm小皿(2mL/皿),在相對濕度95%、5%CO2、37℃下培養(yǎng)24 h后按劑量染毒,設(shè)置空白對照組、處理組(1/10 IC50、1/5 IC50、IC50三個濃度)、陽性對照組,每組設(shè)三個平行試驗。取一定體積的細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含2.8×105個細胞),于離心涂片機(500rpm,5min,低加速度)進行涂片,將上述玻片浸入100%甲醇(10min),于黑暗環(huán)境中放置直至染色,固定后的玻片浸入DAPI液(10min),然后于400X熒光顯微鏡下進行微核計數(shù)。每一組培養(yǎng)液分析2000個單核細胞(非凋亡或死亡)的細胞微核數(shù),每組培養(yǎng)液重復(fù)兩次(等于4000個細胞)計算微核率。(微核觀察需注意一下條件:微核為近圓形,同細胞主核染色近乎相同,Size≤1/3細胞主核,微核與主核接觸但并不與之重疊)[21]。

      1.4.2 聯(lián)合作用細胞毒性的測定與分析

      采用線性回歸分析CSC、B[a]P、NNK三者之間的聯(lián)合作用。即計算出三種受試物(三個劑量)分別誘發(fā)細胞微核率后,選擇各個受試物低劑量(1/10IC50),再與另外兩種受試物混合后作用BEAS-2B細胞。根據(jù)聯(lián)合染毒誘發(fā)的細胞微核率,計算出CSC、B[a]P、NNK兩兩作用和三者聯(lián)合作用的預(yù)期值[22],并與實際值相比較。實際值小于預(yù)期值,表明受試物之間為協(xié)同作用;實際值大于預(yù)期值,表明受試物之間為拮抗作用;實際值與預(yù)期值接近,表明受試物之間無明顯協(xié)同作用。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 單獨作用遺傳毒性試驗結(jié)果

      由表2可知, CSC、NNK和B[a]P均可誘發(fā)細胞微核率增高,并有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。相同細胞存活劑量條件下,誘發(fā)細胞微核形成能力比較:B[a]P>NNK>CSC。

      表2 CSC、NNK、B[a]P單獨作用誘發(fā)BEAS-2B細胞微核率

      2.2 聯(lián)合作用遺傳毒性

      2.2.1 B[a]P與CSC聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核率

      由圖1可知,固定低劑量B[a]P(1/10 IC50)與不同濃度CSC聯(lián)合作用,固定低劑量CSC(1/10 IC50)與不同濃度B[a]P聯(lián)合作用,隨著劑量的增加,細胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢,表現(xiàn)劑量依賴趨勢。誘發(fā)細胞微核率均顯著低于預(yù)期值,并與作用的先后順序無關(guān),特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng),提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細胞微核能力比較∶ B[a]P+CSC > CSC+ B[a]P。

      2.2.2 CSC與NNK聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核率

      由圖2可知,固定低劑量CSC(1/10 IC50)與不同濃度NNK聯(lián)合作用,固定低劑量NNK(1/10IC50)與不同濃度CSC聯(lián)合作用,隨著劑量的增加,細胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢,表現(xiàn)劑量依賴趨勢。誘發(fā)細胞微核率明顯低于預(yù)期值,并與作用的先后順序無關(guān),特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng),提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細胞微核能力比較∶NNK+CSC > CSC+NNK。

      圖1 B[a]P與CSC聯(lián)合作用對BEAS-2B細胞微核率的影響

      圖2 CSC與NNK聯(lián)合作用對BEAS-2B細胞微核率的影響

      2.2.3 B[a]P與NNK聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核率

      由圖3可知,固定低劑量B[a]P(1/10 IC50)與不同濃度NNK聯(lián)合作用,固定低劑量NNK(1/10 IC50)與不同濃度B[a]P聯(lián)合作用,隨著劑量的增加,細胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢,表現(xiàn)劑量依賴趨勢。誘發(fā)細胞微核率顯著低于預(yù)期值,特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng),提示兩者聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。誘發(fā)細胞微核能力比較∶NNK+B[a]P > B[a]P+ NNK。

      圖3 B[a]P與NNK聯(lián)合作用對BEAS-2B細胞微核率的影響

      2.2.4 CSC、B[a]P與NNK三者聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核率

      由圖4可知,三者聯(lián)合作用隨著劑量的增加,細胞微核率均呈現(xiàn)上升趨勢,表現(xiàn)劑量依賴趨勢。誘發(fā)細胞微核率顯著低于理論預(yù)期值2,但與理論預(yù)期值1的結(jié)果相差較小。特別是固定低劑量B[a]P(1/10 IC50)和固定低劑量NNK(1/10 IC50)存在時,再加入CSC誘發(fā)的細胞微核率接近理論預(yù)期值1,提示有較弱的相互作用(弱相加)。誘發(fā)細胞微核能力 比 較 ∶ (B[a]P+NNK)+CSC > (CSC+B[a]P)+NNK >(NNK+CSC)+B[a]P。

      圖4 CSC、B[a]P與NNK三者聯(lián)合作用對BEAS-2B細胞微核率的影響

      3 討論

      相關(guān)研究[23-24]表明,支氣管上皮細胞為吸入式有害物質(zhì)在體內(nèi)代謝活化的主要場所。本實驗所用BEAS-2B細胞,是由正常人支氣管上皮細胞經(jīng)腺病毒-12/SV40雜交病毒感染,連續(xù)傳代篩選而永生化所得,是研究肺癌相關(guān)機理的重要靶細胞。B[a]P可導(dǎo)致肺癌A549細胞DNA損傷,使細胞周期發(fā)生阻滯[25];B[a]P與多氯聯(lián)苯聯(lián)合作用時,能抑制B[a]P代謝產(chǎn)物葡萄糖化,減緩B[a]P代謝速率[26];2, 4,6 - 三硝基甲苯(TNT)與B[a]P呈拮抗效應(yīng),可阻止B[a]P進入細胞[27]。NNK在煙草中含量高,能造成細胞的氧化損傷[28],誘導(dǎo)支氣管上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化[29], 與肺癌的相關(guān)性很高[30]。α粒子和NNK聯(lián)合作用于BEP-2D細胞時,協(xié)同效應(yīng)顯著[31],而B[a]P和NNK之間的聯(lián)合作用卻少見文獻報道。探究B[a]P、NNK在卷煙煙氣復(fù)雜基質(zhì)中的相互作用關(guān)系,有利于分析卷煙煙氣有害物質(zhì)的毒性作用及相關(guān)機理,構(gòu)建符合其特征性的危害性研究方法。

      本試驗以BEAS-2B為靶細胞,通過對CSC及其最具代表性的有害成分NNK和B[a]P的聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核能力進行分析,發(fā)現(xiàn)B[a]P、NNK與CSC均具有體外細胞誘變性,且存在明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。B[a]P與CSC的聯(lián)合作用、B[a]P與NNK的聯(lián)合作用、CSC與NNK的聯(lián)合作用均具有劑量依賴效應(yīng),但比預(yù)期毒性小,并與作用的先后順序無關(guān)。特別是在較低劑量是與單純作用結(jié)果相當(dāng),提示兩兩聯(lián)合作用誘發(fā)細胞微核存在一定的拮抗效應(yīng)。三者聯(lián)合作用時均具明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,誘發(fā)細胞微核率顯著低于理論預(yù)期值2,但與理論預(yù)期值1的結(jié)果相差較小。特別是固定低劑量B[a]P(1/10 IC50)和固定低劑量NNK(1/10 IC50)存在時,再加入CSC誘發(fā)的細胞微核率接近理論預(yù)期值1,提示有較弱的相互作用(弱相加)。筆者推測B[a]P和NNK可能與卷煙煙氣中其他成分發(fā)生協(xié)同作用作用,隨著CSC含量的上升,激活了BEAS-2B細胞CSC中其他物質(zhì)代謝的相關(guān)酶類物質(zhì),促使CSC代謝加快,表現(xiàn)為誘發(fā)微核率上升趨勢較快,增大了細胞的遺傳毒性。

      4 小結(jié)

      本研究證實B[a]P、NNK與CSC之間兩兩聯(lián)合存在拮抗作用,而三者之間的聯(lián)合作用呈現(xiàn)協(xié)同(弱相加)效應(yīng)。這一結(jié)果,對評價卷煙煙氣中有害成分的危害性具有一定的指導(dǎo)意義。同時也提示卷煙煙氣中其他有害成分(如苯酚、巴豆醛、重金屬等)物質(zhì)之間的相關(guān)性,有待進一步研究。

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