嚴(yán)蕾，唐建國

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷-急救-危重醫(yī)學(xué)中心，上海 200240

假絲酵母(俗稱念珠菌)是人體皮膚、黏膜的常見寄生真菌，也是臨床上重要的條件致病性真菌。近10年來盡管新的抗真菌藥物層出不窮，但醫(yī)院獲得性念珠菌菌血癥發(fā)病率依然呈上升趨勢，侵入性念珠菌病的病死率也居高不下[1,2]。念珠菌入侵機(jī)體造成感染的第1步是黏附于皮膚和黏膜等部位或靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管等植入物。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展為人們研究念珠菌細(xì)胞壁上各種黏附蛋白的功能提供了有利的工具。念珠菌糖基磷脂酰肌醇錨定細(xì)胞壁蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored cell wall protein，GPI-CWP)幾乎都有共同的結(jié)構(gòu)特征：氨基端(N端)信號(hào)序列、長度多變的絲氨酸/蘇氨酸區(qū)和羧基端(C端)GPI錨定區(qū)[3]。GPI-CWP不僅參與念珠菌細(xì)胞壁的合成及重構(gòu)，還在介導(dǎo)念珠菌黏附至宿主上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)方面具有舉足輕重的作用[3]?，F(xiàn)就重要的念珠菌黏附相關(guān)GPI-CWP：凝集素樣序列(agglutinin-like sequence，Als)、菌絲壁蛋白 1(hyphal cell wall protein 1，Hwp1)、上皮細(xì)胞黏附素(epithelial adhesin，Epa)、聚苯乙烯黏附增強(qiáng)蛋白1(enhanced adherence to polystyrene 1，Eap1)等的致病機(jī)制展開綜述。

1 Als

Als家族是白色念珠菌的重要毒力因子，不僅參白色念珠菌黏附宿主，深部侵襲，還與生物膜的形成密切相關(guān)。als基因家族目前共發(fā)現(xiàn)8個(gè)成員(als1～7和als9)。最近還發(fā)現(xiàn)als5、als1鄰近位點(diǎn)重組產(chǎn)生的一種新基因als51，它有與als5類似的5′ 端和與als1類似的3′ 端[4]。als基因家族各成員在白色念珠菌黏附不同組織時(shí)表達(dá)不一，白色念珠菌黏附至不同的組織受不同Als調(diào)節(jié)。Green等[5]刮取人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)陽性患者口腔組織進(jìn)行白色念珠菌als表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，als1、als2、als3和als9幾乎在所有樣本中均有表達(dá)，als5、als7的陽性率為83%，而als6僅為50%。Als1、Als3和Als5促進(jìn)白色念珠菌黏附至包括口腔上皮、陰道上皮及細(xì)胞外基質(zhì)在內(nèi)的多種宿主組織，而Als6和Als9僅能調(diào)節(jié)白色念珠菌黏附至少量的宿主細(xì)胞，甚至不能促進(jìn)黏附至上皮細(xì)胞[6,7]。因此，als基因的表達(dá)具有組織特異性，不同的Als蛋白在白色念珠菌黏附過程中的功能可能相互協(xié)同或相互拮抗，使白色念珠菌以適當(dāng)?shù)乃金じ剿拗?，既利于其在體內(nèi)長期定植，又可播散。Als蛋白也并非白色念珠菌所特有，研究發(fā)現(xiàn)在熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、吉利蒙念珠菌細(xì)胞壁上均有Als蛋白家族成員表達(dá)，但對其在非白色念珠菌致病機(jī)制中的研究還比較少[8]。

近年來，Als3由于在白色念珠菌致病的多個(gè)環(huán)節(jié)中起作用而受到廣泛關(guān)注。它不僅調(diào)節(jié)白色念珠菌黏附至機(jī)體上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，還促進(jìn)白色念珠菌形成生物膜。通過Als3與體內(nèi)常駐菌如口腔格氏鏈球菌的單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein，Ssb)交互作用，菌絲相的白色念珠菌可與體內(nèi)鏈球菌相連接，促進(jìn)白色念珠菌生物膜形成及在體內(nèi)穩(wěn)定定植[9]。在生物膜的屏蔽下，白色念珠菌可逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)及抗真菌藥物的殺傷，引起慢性持續(xù)性感染。Als3綁定至宿主細(xì)胞表面E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白后，通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞內(nèi)吞作用而促進(jìn)白色念珠菌入侵宿主上皮[7,10]。Als3還會(huì)破壞上皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞釋放粒細(xì)胞集 落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和 IL-1α[10]。此外，白色念珠菌可通過Als3綁定至鐵蛋白，利用宿主鐵蛋白作為自身鐵的來源[7]。但一些學(xué)者由于發(fā)現(xiàn)白色念珠菌als3基因突變株依然能形成正常菌絲，黏附微血管內(nèi)皮細(xì)胞并引起擴(kuò)散性念珠菌病，故認(rèn)為Als3并非念珠菌毒力所必需[11]。我們對這種觀點(diǎn)存在質(zhì)疑。念珠菌黏附宿主不同組織受不同Als蛋白調(diào)節(jié)，不同Als蛋白在功能上存在重疊。當(dāng)一種基因突變時(shí)，其他基因可能會(huì)代償性表達(dá)增加，使念珠菌保持黏附能力。因此，用一種基因突變模型來研究念珠菌毒力方法的可行性還有待進(jìn)一步探討。

2 Hwp1

Hwp1是一種主要在白色念珠菌菌絲表面表達(dá)的甘露糖蛋白。Hwp1的N端結(jié)構(gòu)域與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)相互作用，使白色念珠菌以共價(jià)形式連接至上皮細(xì)胞。TGase的底物通常是富含脯氨酸的小蛋白(small proline-rich protein，Spr)，Hwp1通過模擬這些小蛋白的功能而促進(jìn)念珠菌連接至分化相對成熟的且膜上具有一種Spr3和角蛋白13的上皮細(xì)胞，但對分化不成熟的上皮細(xì)胞黏附能力較弱[12,13]。

hwp1表達(dá)受cAMP信號(hào)途徑的精密調(diào)節(jié)。Wolyniak等[14]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用破壞肌動(dòng)蛋白絲的細(xì)胞松弛素A和分隔肌動(dòng)蛋白單體的拉春庫林后，cAMP信號(hào)途徑均被破壞，hwp1表達(dá)減少。相反，應(yīng)用F肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定劑會(huì)上調(diào)cAMP水平，hwp1高表達(dá)。因此，肌動(dòng)蛋白可調(diào)控hwp1的表達(dá)。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hwp1表達(dá)分為2個(gè)時(shí)相：先是不依賴于肌動(dòng)蛋白的慢相，隨后是依賴于肌動(dòng)蛋白的快相。白色念珠菌菌絲的形成也經(jīng)歷2個(gè)階段：初始階段主要是芽管極化和Hwp1及其他菌絲調(diào)節(jié)蛋白沉積，該過程與hwp1表達(dá)的慢相相關(guān)；第2階段主要是芽管延長，與依賴肌動(dòng)蛋白聚集的快相相關(guān)[14]。通過藥物干擾F肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性，可抑制念珠菌菌絲生長，降低真菌毒力。

在轉(zhuǎn)錄因子Bcl-1的調(diào)節(jié)下，Hwp1參與體內(nèi)外白色念珠菌生物膜的形成。bcl-1突變的念珠菌在人體內(nèi)只能形成小而不穩(wěn)定的生物膜。但當(dāng)hwp1過量表達(dá)時(shí)，可增加bcl-1突變株生物膜的形成并明顯提高小鼠舌部念珠菌負(fù)荷[15]。Nobile等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Hwp1與Als1、Als3在生物膜形成中功能互補(bǔ)。在體外，白色念珠菌野生株可形成>100 μ m厚的生物膜，而hwp1突變株和als1/als3雙突變株僅形成5～20 μ m厚的生物膜。將這2種突變株混合后培養(yǎng)，又能形成厚度>100 μ m的生物膜。利用白色念珠菌感染導(dǎo)管模型的研究發(fā)現(xiàn)，每種突變株單獨(dú)形成的有缺陷的生物膜中，僅有少量具有黏附功能的念珠菌，且沒有明顯的細(xì)胞外基質(zhì)。相反，2種突變株混合形成的生物膜中有豐富的酵母細(xì)胞、菌絲纖維和細(xì)胞外基質(zhì)[16]。Hwp1、Als1和Als3在體內(nèi)外協(xié)同促進(jìn)形成具有念珠菌特色的生物膜[16]。此外，Hwp1與白色念珠菌的交配凝集素同源，能參與念珠菌性別分化，有利于念珠菌交配。但在一定條件下，白色念珠菌可能重新安排表面蛋白，節(jié)約用于交配的Hwp1可更多地形成生物膜，有利于其長期生存[16]。

3 Epa

光滑念珠菌在引起念珠菌菌血癥的常見念珠菌中排第2位，全世界15%～20%的念珠菌血流感染由光滑念珠菌引起[17]。利用Epa蛋白，光滑念珠菌可在體內(nèi)外緊緊黏附至哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。大多數(shù)epa基因位于亞端粒區(qū)，亞端粒區(qū)的基因轉(zhuǎn)錄沉默抑制其表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄沉默幾乎均依賴于沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(silent information regulator protein 2，Sir2)、Sir3、Sir4和Ras相關(guān)蛋白1(Ras-proximate 1 or Ras-related protein 1，Rap1)的調(diào)控，而 Hdf1、Hdf2和Rif1在特定亞端粒區(qū)也能抑制轉(zhuǎn)錄[18]。所有這些蛋白均參與epa1亞端粒區(qū)轉(zhuǎn)錄沉默，從而抑制epa1轉(zhuǎn)錄[19]。但epa2和epa3基因的轉(zhuǎn)錄沉默只依賴Sir2、Sir3、Sir4和 Rif1，不受Hdf1和Hdf2的調(diào)節(jié)[20]。這是由于在epa3與端粒之間有一個(gè)與Hdf1、Hdf2蛋白在功能上有交叉的順式作用元件沉默子Sil2126，其作用具有位置特異性，只有當(dāng)它位于距特定端粒31.9 kb處時(shí)才會(huì)使基因表達(dá)沉默[20]。Gallegos-García等[19]發(fā)現(xiàn)，將處于靜止期的光滑念珠菌在新鮮介質(zhì)中稀釋后，epa1基因轉(zhuǎn)錄立刻被激活，使念珠菌黏附能力增強(qiáng)，但該基因轉(zhuǎn)錄很快又被抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)錄激活是受轉(zhuǎn)錄激活因子LP-Ac的誘導(dǎo)。epa1表達(dá)抑制受2種不同途徑的調(diào)節(jié)：依賴于Sir蛋白的轉(zhuǎn)錄沉默，以及Hdf1、Hdf2通過終止密碼子TAA下游300 bp處的順式作用負(fù)調(diào)控元件調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制[19]。在這些機(jī)制的精確調(diào)控下，epa1轉(zhuǎn)錄增加只局限于停滯期，而在對數(shù)期和靜止期轉(zhuǎn)錄被抑制[19]。

Epa家族共有23種Epa蛋白參與念珠菌的黏附過程。目前研究最為深入的是Epa1、Epa6和Epa7。Epa1在體內(nèi)外均能發(fā)揮促黏附功能，而光滑念珠菌體外黏附也主要依賴于Epa1。Kuhn等[21]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞雖可通過菌體表面Epa1識(shí)別光滑念珠菌，但不能吞噬它們和釋放炎癥介質(zhì)。由此光滑念珠菌可逃避機(jī)體天然免疫，長期定植于宿主，可部分解釋人體發(fā)生光滑念珠菌菌血癥后的高病死率。光滑念珠菌Epa6和Epa7也被認(rèn)為是輔助光滑念珠菌定植的重要毒力因子，Epa6還促進(jìn)光滑念珠菌形成生物膜[22,23]。在配基方面，Epa1、Epa6和Epa7均可連接至宿主細(xì)胞表面末端為半乳糖殘基的多糖上。Epa6的配基最廣泛，Epa1次之，而Epa7與Epa6的氨基酸雖有92%相似，但由于N端5個(gè)氨基酸的差異，Epa7能綁定的末端僅局限于Galβ 1-3Gal(GalNAc)或 Galβ 1-4Glc(GlcNAc)雙糖的配基，因此Epa7的宿主組織特異性最強(qiáng)[24]。

4 Eap1

eap1的轉(zhuǎn)錄由cAMP依賴的蛋白激酶途徑激活，并受轉(zhuǎn)錄因子Efg1的精確調(diào)控[25]。Eap1不僅具有促進(jìn)菌體黏附腎上皮細(xì)胞和聚苯乙烯的能力，還促進(jìn)白色念珠菌生物膜的形成[25,26]。與Als3一樣，Eap1也是白色念珠菌連接體內(nèi)格氏鏈球菌的重要蛋白，使念珠菌廣泛定植于人體[27]。Li等[28]用無黏附作用的釀酒酵母研究Eap1不同區(qū)域作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，Eap1的 N端參與調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞之間相互黏附及促進(jìn)侵入性生長。C端串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)能使N端配體結(jié)合區(qū)域伸展到細(xì)胞外環(huán)境，從而介導(dǎo)菌體黏附至聚苯乙烯和宿主上皮細(xì)胞[28]。由于N端配體結(jié)合區(qū)域遠(yuǎn)離菌體，因此可針對該N端配體結(jié)合區(qū)域設(shè)計(jì)抗體與之結(jié)合，阻礙白色念珠菌的黏附、定植。然而迄今為止，對宿主細(xì)胞表面Eap1的靶受體研究甚少，因此對Eap1的致病機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

5 其他GPI-CWP

白色念珠菌的Ecm33是體外維持念珠菌細(xì)胞壁完整性，參與菌絲相轉(zhuǎn)變、黏附的重要蛋白。ecm33突變株會(huì)減少凋亡信號(hào)分子Bax激活，抑制生物膜形成，降低白色念珠菌對齒齦黏膜組織的破壞性[29]。Ywp1主要出現(xiàn)在酵母相念珠菌表面。白色念珠菌表面缺乏Ywp1時(shí)會(huì)變得更有黏附性并形成厚厚的生物膜，提示Ywp1具有抗黏附能力，從而促進(jìn)酵母細(xì)胞播散[30]。近期研究認(rèn)為，Ywp1中含有N-連接聚糖的相對分子質(zhì)量為11 000的前肽具有抑制黏附作用[30]。iff4過量表達(dá)會(huì)提高白色念珠菌黏附至口腔上皮細(xì)胞的水平，增強(qiáng)其在小鼠念珠菌性陰道炎模型中的毒力。然而，過量表達(dá)Iff4的白色念珠菌易被中性粒細(xì)胞殺滅，降低在非中性粒細(xì)胞減少小鼠中的血流播散[31]。因此，只有表達(dá)適當(dāng)水平的Iff4，才能使念珠菌具有最強(qiáng)的致病性。

6 結(jié)語

念珠菌黏附宿主是其致病的第1步，黏附能力大小決定其毒力水平。目前已發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的念珠菌黏附相關(guān)GPI-CWP，但相應(yīng)的致病機(jī)制尚未完全闡明。主要原因可能是各種黏附蛋白功能重疊，使一種基因突變的常用方法往往不能正確反映該蛋白的功能。近年來，根據(jù)念珠菌細(xì)胞壁上蛋白-蛋白交互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)中位置鄰近的蛋白功能相似而相同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因功能類似的特點(diǎn)，利用細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)方法預(yù)測念珠菌黏附相關(guān)基因，有助于進(jìn)一步揭示念珠菌的致病機(jī)制[32]。此外，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增菌種特異性黏附相關(guān)目的基因，將有助于臨床鑒別感染的念珠菌菌種。針對念珠菌黏附過程設(shè)計(jì)相應(yīng)的防治方案無疑也具有重要臨床意義，但相應(yīng)的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)依舊任重道遠(yuǎn)。

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