林 濤 陳興連 李彥剛 樊建麟

劉興勇2 蘭珊珊1，2 劉宏程1，2

（1．農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（昆明），云南 昆明 650223；

2．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650223）

氯吡脲（結(jié)構(gòu)見圖1），別名脲動素、吡效隆等，具有加速細胞有絲分裂、促進細胞的增大和分化、防止落花落果等作用［1，2］，常作為獼猴桃、葡萄、西瓜、黃瓜等果蔬的生長調(diào)節(jié)劑而應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［3－6］，但是殘留于果蔬中的氯吡脲可能會對人類及其他生物造成潛在的威脅，如對人、畜和鳥類等有低毒性，對皮膚和眼睛有輕度的刺激作用，而對魚類有中等毒性等［7－9］。因此，近年來對于氯吡脲在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的用量，各國都制定了嚴格的最大殘留限量要求。

圖1 氯吡脲結(jié)構(gòu)Figure1 The structure of forchlorfenuron

目前，用于氯吡脲殘留檢測的方法較多，主要包括免疫學(xué)方法［10，11］、氣相色譜法［12］、液相色譜法［13，14］和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［15，16］等，其中液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法因其測定快速精確、檢出限較低而廣泛應(yīng)用于氯吡脲殘留的檢測中。本研究基于超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，擬采用快捷簡便的樣品提取方法，比較3種固相萃取柱的凈化富集效果，并在測定過程中對串聯(lián)質(zhì)譜儀的相關(guān)條件進行優(yōu)化，以建立快速檢測葡萄中氯吡脲殘留的分析方法。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 材料與試劑

新鮮葡萄：購于云南省昆明市五華區(qū)江岸小區(qū)農(nóng)貿(mào)市場和江北農(nóng)貿(mào)市場；

乙腈、甲醇：色譜純，德國Merck公司；

二氯甲烷、丙酮、正己烷、乙酸銨、氯化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。

1．1．2 主要儀器設(shè)備

超高壓液相色譜儀：Agilent 1290型，美國Agilent公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 6460 型，美國Agilent公司；

氮吹儀：OA－SYS型，美國Organomation公司；

電子分析天平：AE－100型，瑞士Mettler Toledo公司；

高速勻漿機：IKA T18ULTRA－TURRAX型，德國IKA集團；

食品加工機：HR7625型，荷蘭Philips電子公司；

回旋式震蕩儀：HY－5 型，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

LC－NH2 SPE tubes：500 mg／3 mL，美 國Supelclean公司；

LC－Florisil SPE tubes：1g／6mL，美國Supelclean公司；

Bond Elut Alumina－B SPE tubes：500 mg／3 mL，美 國Varian公司。

1．2 方法

1．2．1 標準溶液配制

（1）標準儲備溶液：準確稱取0．05g氯吡脲的標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為5 mg／mL 的標準儲備液，于低溫下避光保存。

（2）標準工作溶液：用移液管準確吸取一定量的標準儲備溶液，用甲醇逐級稀釋，分別配制成0．5，1．0，2．0，5．0，10．0ng／mL的系列標準工作溶液。

1．2．2 色譜條件 采用Agilent 1290 超高壓液相色譜儀，Agilent SB－C18色譜柱（50mm ×2．1mm，1．8μm）；流動相A：1mmoL醋酸銨水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫參數(shù)見表1；流速：0．2mL／min，柱溫：40 ℃，進樣量：2μL。

表1 梯度洗脫參數(shù)Table1 Gradient elution parameters

1．2．3 質(zhì) 譜 條 件 優(yōu) 化 采 用Agilent 6460 Ttiple Quad LC－MS／MS，電噴霧離子源（ESI），首先將2μL氯吡脲的標準溶液（1μg／mL）直接進行質(zhì)譜分析（流動相A／B ＝50／50），在Q1SCAN 模式下確定母離子的質(zhì)荷比（分子量掃描范圍：200～600），并比較在ESI＋和ESI－兩種電離方式下氯吡脲的響應(yīng)值；同時在合適的電離方式下采用Product Ion Scan模式進行子離子及相關(guān)條件的優(yōu)化（Coarse range from 30to 50，Collision energy from 5to 40），得到MRM 離子對。樣品測定時采用上述優(yōu)化得到的MRM 離子對及相關(guān)參數(shù)，在多反應(yīng)檢測（MRM）模式下進行分析。

1．2．4 樣品前處理 參照文獻［17］、［18］的方法，葡萄經(jīng)食品加工機充分粉碎后，準確稱取15．0g葡萄樣品于250 mL的錐形瓶中，加入提取溶劑30 mL，高速勻漿1 min后用濾紙過濾，收集濾液到裝有5．0～7．0g氯化鈉的100mL 具塞量筒中，劇烈振蕩1min，在室溫下靜置1h，待分層完全后準確吸取10．0 mL 上層提取液于150 mL 燒杯中，氮氣吹干，待固相萃取柱凈化。

1．2．5 固相萃取柱洗脫條件優(yōu)化 本試驗中以回收率為指標，優(yōu)化比較了LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取柱的洗脫條件，并比較了LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取柱對于氯吡脲的富集凈化效果，洗脫條件優(yōu)化步驟如下：

（1）LC－NH2 固相萃取柱：LC－NH2 固相萃取柱首先用5．0mL 5%甲醇－二氯甲烷溶液活化，樣品用2．0mL 5%甲醇－二氯甲烷溶液溶解后加入LC－NH2 固相萃取柱，洗脫時分別采用不同比例的甲醇－二氯甲烷溶液（5%，10%，15%，20%）進行并比較洗脫效果，用15mL離心管收集洗脫液；將離心管置于氮吹儀上，于50 ℃水浴條件下，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2．0mL，過有機濾膜待測。

（2）LC－Florisil固相萃取柱：LC－Florisil固相萃取柱首先分別用5．0mL 10%丙酮－正己烷溶液和5．0mL 正己烷活化，樣品用2．0 mL 10%丙酮－正己烷溶液溶解后加入LC－Florisil固相萃取柱，用15 mL 離心管收集洗脫液，洗脫時分別采用不同比例的丙酮－正己烷溶液（10%，20%，30%，40%）沖洗燒杯后淋洗LC－Florisil固相萃取柱并比較洗脫效果；將離心管置于氮吹儀上，于50 ℃水浴條件下，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2．0mL，過有機濾膜待測。

（3）堿性氧化鋁固相萃取柱：堿性氧化鋁固相萃取柱首先分別用5．0 mL 10%丙酮－正己烷溶液活化，樣品用2．0mL 10%丙酮－正己烷溶液溶解后加入堿性氧化鋁固相萃取柱，用15mL離心管收集洗脫液，洗脫時分別采用不同比例的丙酮－正己烷溶液（10%，20%，30%，40%）沖洗燒杯后淋洗堿性氧化鋁固相萃取柱并比較洗脫效果；將離心管置于氮吹儀上，于50 ℃水浴條件下，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至2．0mL，過有機濾膜待測。

1．2．6 樣品測定 待超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀穩(wěn)定后，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，將一定濃度的氯吡脲標準溶液重復(fù)進樣，當相鄰兩針進樣后的響應(yīng)值變化小于3．0%時，分別按照標準溶液、樣品溶液、樣品溶液和標準溶液的順序進樣，以標準品的保留時間和定性離子的相對豐度對氯吡脲進行定性分析，以標準溶液和樣品溶液定量離子的峰面積進行定量分析。

1．2．7 結(jié)果計算 參照文獻［17］的計算方法，對氯吡脲濃度進行計算，并按式（1）計算樣品中的氯吡脲殘留含量：

式中：

ω—— 氯吡脲殘留含量，mg／kg；

ρ—— 氯吡脲標準溶液的質(zhì)量濃度，mg／L；

A—— 樣品中氯吡脲的峰面積，mAu·s；

As—— 氯吡脲標準溶液中的峰面積，mAu·s；

V1—— 提取溶液總體積，mL；

V2—— 吸取用于檢測的提取溶液的體積，mL；

V3—— 樣品溶液定容體積；mL；

m—— 稱樣量，g。

2 結(jié)果與討論

2．1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇

根據(jù)氯吡脲的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，通過Q1SCAN 模式分別對其標準溶液采用ESI＋和ESI－兩種模式分析，結(jié)合氯吡脲的分子量，分析發(fā)現(xiàn)氯吡脲在ESI＋模式下m／z 248［M ＋H］＋處出現(xiàn)分子離子峰，而在ESI－模式下出現(xiàn)了m／z 246［M － H］–的分子離子峰，但是通過比較兩種模式下的響應(yīng)值（圖2），可知氯吡脲在ESI＋模式下明顯比ESI－模式下的響應(yīng)值大，因此選擇ESI＋模式進行后續(xù)的相關(guān)分析。

同時通過Product Ion Scan模式進行子離子及相關(guān)條件的優(yōu)化，得到MRM 離子對和優(yōu)化后的相關(guān)條件，見表2、3。

根據(jù)以上優(yōu)化得到的相關(guān)質(zhì)譜條件，將10ng／mL 的氯吡脲標準工作溶液進樣分析，得到氯吡脲標準在MRM 模式下的總離子流圖譜（TIC）見圖3，保留時間為5．468min，圖4為MRM 模式下248→93、248→129母離子和兩種子離子組合的圖譜，其中248→129為定量離子。

圖2 兩種電離方式下氯吡脲的響應(yīng)值Figure2 The response of forchlorfenuron by two ionization mode

圖3 氯吡脲標準溶液超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜總離子流圖譜（10ng／mL）Figure3 The UPLC－MS／MS total ion current spectrum of the forchlorfenuron stand ard solution（10ng／mL）

2．2 提取溶劑的選擇

在氯吡脲殘留檢測分析中常用的提取溶劑主要有乙腈［19］和甲醇［20］等，本試驗中以葡萄樣品為試驗對象，分別選用了乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯4種農(nóng)藥殘留檢測中常用的提取溶劑，并在相同的試驗條件下，以10．0μg／kg的添加水平進行加標回收試驗，提取效果圖譜見圖5，4種常規(guī)提取溶劑的回收率依次為93．1%，85．3%，69．8%，67．5%，表明丙酮和乙酸乙酯的提取效果比乙腈和甲醇差，而乙腈的提取效果比甲醇好，因此本試驗中采用乙腈作為氯吡脲殘留檢測中的提取溶劑。

表2 氯吡脲檢測條件優(yōu)化結(jié)果Table2 The optimization results of forchlorfenuron determination conditions

表3 MRM 模式下氯吡脲的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果Table3 The optimization results of forchlorfenuron MS parameters by MRM mode

圖4 氯吡脲標準溶液超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜子離子圖譜（10ng／mL）Figure4 The UPLC－MS／MS product ion spectrum of the forchlorfenuron standard solution（10ng／mL）

圖5 不同提取溶劑的提取效果比較Figure5 The comparison of the extraction effect of different extraction solvent

2．3 固相萃取柱洗脫條件優(yōu)化

本試驗中以葡萄樣品為試驗對象，以10．0μg／kg的添加水平進行加標回收試驗，在相同的試驗條件下分別優(yōu)化了LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取柱的洗脫條件，由圖6可知：LC－NH2固相萃取柱隨著甲醇比例的增大回收率逐漸增大，但是當甲醇比例超過15%以后其回收率降低；LC－Florisil固相萃取柱隨著丙酮比例的增大回收率逐漸增大，但是當丙酮比例超過20%以后其回收率增大趨勢變緩，甚至沒有變化；堿性氧化鋁固相萃取柱隨著丙酮比例的增大回收率逐漸增大，其回收率在丙酮比例為30%時最大。因此確定LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取柱的洗脫條件分別為：15%甲醇－二氯甲烷溶液，20%丙酮－正己烷溶液，30%丙酮－正己烷溶液。

圖6 3種固相萃取柱洗脫條件優(yōu)化Figure6 The elution condition optimization of there kinds of solid phase extraction column

2．4 固相萃取柱凈化富集效果比較

試驗分別比較了LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取小柱的凈化富集效果，以葡萄樣品的加標回收率為比較指標，最終確定了NH2固相萃取柱對葡萄中氯吡脲的凈化富集效果較優(yōu)，不同固相萃取柱在不同添加濃度下的回收率見表4。

表4 3種固相萃取小柱的加標回收率及相對標準偏差Table4 The spiked recoveries and relative standard deviation of three kinds of solid phase extraction column（n ＝3）

2．5 線性范圍和檢出限

將不同濃度的標準工作溶液進行UPLC－MS／MS 分析，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標作圖，得到氯吡脲的標準曲線、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明氯吡脲在0．5～10ng／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好（見圖7），檢出限為0．1μg／kg，定量限為0．3μg／kg。

圖7 氯吡脲標準溶液工作曲線Figure7 The standard solution curve of forchlorfenuron

2．6 回收率和精密度

采用標準添加回收的方法，在不含氯吡脲的水果基質(zhì)中添加不同濃度的氯吡脲標準物質(zhì)，每種樣品設(shè)置3個添加水平，分別為0．5，2．0，5．0μg／kg，按照上述的樣品前處理、固相萃取和UPLC－MS／MS 方法測定并計算回收率和精密度，結(jié)果見表4。由表4可知，3種固相萃取柱的凈化富集效果均能達到常規(guī)的檢測要求，但是LC－NH2固相萃取柱對于氯吡脲的凈化富集效果相對較好，回收率范圍為81．2%～96．4%，相對標準偏差范圍為3．7%～4．5%。

2．7 水果樣品的測定

對市場上購買的10個葡萄樣品中氯吡脲殘留情況進行測定，測定結(jié)果為10個葡萄樣品中均未檢測出氯吡脲。

3 結(jié)論

本試驗以葡萄為基質(zhì)，首先針對氯吡脲的化學(xué)性質(zhì)，分別比較了乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯4種常規(guī)提取溶劑對氯吡脲的提取效果，同時根據(jù)LC－NH2、LC－Florisil和堿性氧化鋁固相萃取柱中填料性質(zhì)的不同，在不同的洗脫溶劑比例下分別比較了3種固相萃取柱對氯吡脲的富集凈化效果，并在此基礎(chǔ)上對串聯(lián)質(zhì)譜的相關(guān)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，乙腈對葡萄中的氯吡脲具有較好的提取效果，LC－NH2固相萃取柱對氯吡脲具有較好的富集凈化效果；優(yōu)化后的串聯(lián)質(zhì)譜條件對氯吡脲的檢測具有較高的靈敏度，該方法操作簡便，準確度高、重現(xiàn)性好，適于水果中氯吡脲殘留的分析檢測。

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