劉 璐，夏利寧，姚 剛，趙紅瓊

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

Ghrelin的發(fā)現(xiàn)之旅源于人們觀察到嗎啡具有促進(jìn)生長激素（growth hormone，GH）分泌的作用，進(jìn)而在動(dòng)物體中分離到了腦啡肽類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)合成了一系列腦啡肽類似物，它們具有選擇性促進(jìn)GH 分泌的作用，這些類似物被稱為促生長激素釋放物（GH-secretagogue，GHS）［1］。1996年，美國科學(xué)家Howard等在人和豬的下丘腦、垂體、腹內(nèi)側(cè)核和漏斗核發(fā)現(xiàn)并克隆出了一種G 蛋白偶聯(lián)受體，并且證明了它是其中一種合成的促生長激素釋放物MK-0677作用的受體，因而該受體被命名為生長激素促泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHS-R），但其內(nèi)源性配體尚不清楚。此后很多相關(guān)研究小組開始尋找這個(gè)受體的內(nèi)源性配體。1999年，日本科學(xué)家Kojima利用能夠穩(wěn)定表達(dá)GHS-R 的細(xì)胞株，從大鼠胃中首先提純出含28個(gè)氨基酸的活性多肽。該多肽可以激活GHS-R 并刺激GH 的分泌。這種GHS-R 的內(nèi)源性配體被命名為Ghrelin?！癵hre”在原始印歐語中具有“生長”的意思，“gh”是生長激素的縮寫，“rel”可以看做“release（釋放）”的一部分［2］，因此用Ghrelin來命名一個(gè)具有促進(jìn)生長激素釋放活性的多肽是相當(dāng)貼切的。由于Ghrelin的發(fā)現(xiàn)只有十幾年，我國學(xué)術(shù)界對Ghrelin的翻譯也不統(tǒng)一，主要有“生長激素釋放肽”、“生長素”、“胃促生長素”、“胃饑餓素”和“促生長激素釋放激素受體配體”等。由于Ghrelin的中文翻譯的不統(tǒng)一，故而我國很多研究人員在論文中直接使用其英文名稱。

Ghrelin多肽N-端第3位的絲氨酸殘基被疏水的n-辛?；揎?，這對于維持Ghrelin 的活性是必需的，這種被修飾的Ghrelin 被稱為?；疓hrelin。目前已發(fā)現(xiàn)的Ghrelin 受體有GHS-R 1a 和GHS-R 1b 兩 種 型。GHS-R 1a為Ghrelin的功能性受體，Ghrelin 的促GH 釋放效應(yīng)主要是通過與GHS-R 1a結(jié)合而發(fā)揮的，而GHS-R1b目前未發(fā)現(xiàn)其藥理學(xué)活性。用放射免疫法（RIA）測定表明，荷斯坦牛6月齡母牛血漿總Ghrelin（包括?；疓hrelin、非酰基化Ghrelin和Ghrelin的C-端殘基）的生理水平2.8ng／mL±0.7ng／mL是?；疓hrelin生理 水平195.1pg／mL±33.7pg／mL 的16倍［3］。根據(jù)Uniprot中Ghrelin序列比較，顯示Ghrelin N-端的10個(gè)氨基酸序列在哺乳動(dòng)物呈高度保守，證明其N-端氨基酸序列在執(zhí)行生物學(xué)功能方面的重要性。牛和羊Ghrelin為27個(gè)氨基酸的形式，只有17位的1個(gè)氨基酸不同（羊?yàn)楦彼?，牛為精氨酸）?/p>

1 反芻動(dòng)物Ghrelin的組織分布

探查反芻動(dòng)物Ghrelin 的組織分布，有利于了解分泌Ghrelin的主要組織，為探究機(jī)體是如何調(diào)控Ghrelin打下基礎(chǔ)。Ghrelin免疫活性細(xì)胞廣泛的分布于牛、綿羊和馬的頸部到胃底泌酸腺。對Kazak公綿羊的下丘腦、垂體、心臟、肝臟、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸和背最長肌進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)有Ghrelin mRNA 的分布，其中在皺胃中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織［4］。在奶牛乳清和乳中均檢測到?；头酋；疓hrelin的存在［5］。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí)Ghrelin 基因在烏珠穆沁羊子宮體、輸卵管、子宮頸和陰道組織內(nèi)均有表達(dá)且表達(dá)量不同，子宮體表達(dá)量最高，輸卵管次之，子宮頸和陰道內(nèi)的表達(dá)量最少［6］。在羊卵母細(xì)胞檢測到了Ghrelin 和GHS-R1a的mRNA 及其蛋白質(zhì)的存在［7］。在內(nèi)蒙古羊卵泡中也檢測到了Ghrelin mRNA 及其多肽的存在，并且發(fā)現(xiàn)不同周期Ghrelin mRNA 的表達(dá)量也不同，在黃體生成期最高，而消退期最低［6］。Ghrelin／GHS-R 系統(tǒng)在生殖系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)從組織學(xué)角度提示Ghrelin可能與反芻動(dòng)物生殖周期的調(diào)節(jié)和妊娠有重要關(guān)系。

2 Ghrelin對反芻動(dòng)物的生物學(xué)作用

2.1 對生長激素分泌的調(diào)控

在反芻動(dòng)物體內(nèi)外試驗(yàn)均證明，Ghrelin不論是靜脈注射、動(dòng)脈注射、腦內(nèi)注射，還是在離體試驗(yàn)中，均能夠促進(jìn)生長激素（GH）的釋放，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，該作用比下丘腦生長激素釋放素（GHRH）的作用弱。但是3μ／kg體重rGhrelin對GH的釋放作用弱于2.5μ／kg體重鼠GHRH［9］，提示Ghrelin雖然可以促進(jìn)GH 的分泌，但是其作用效果弱于GHRH。ThidarMyint等研究表明靜脈一次性分別注射bGhrelin和人GHRH（hGHRH）在斷奶前后犢牛均能夠升高血漿GH 水平，然而將bGhrelin和hGHRH 同時(shí)注射，在斷奶前顯示出了協(xié)同升高GH 水平，但是在斷奶后這種協(xié)同作用未檢測到［10］。莎能奶山羊靜脈 注射Ghrelin（3.0 μg／kg），3h 后 宰 殺，檢 測 發(fā)現(xiàn)下丘腦中GHRH mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)［11］。但在小公牛下丘腦基底部弓狀核輸注10nmol的rGhrelin 顯著地促進(jìn)GH 釋放（P＜0.05），并且在輸注后10min檢測到峰值，在1h后降低至正常水平［9］。這些研究結(jié)果說明，Ghrelin 可能是通過GHRH 途徑調(diào)節(jié)垂體GH 釋放，也可能間接地通過下丘腦來完成這種作用。

Ghrelin分子存在兩種形式，即酰基化Ghrelin和去?；疓hrelin。?；疓hrelin能夠促進(jìn)綿羊GH 的分泌，調(diào)節(jié)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素等激素的分泌［12］。在靜脈注射酰基化bGhrelin（1.0 U／kg體重）之前5 min 注射非?；痓Ghrelin（10.0 μg／kg體重），并未影響?；疓hrelin的促GH 和胰島素釋放作用［13］，提示非?；疓hrelin可能不是酰基化Ghrelin在調(diào)控內(nèi)分泌作用中的頡頏劑。

2.2 促進(jìn)食欲、調(diào)節(jié)能量平衡

在單胃動(dòng)物研究普遍認(rèn)為Ghrelin可能通過胃腸道、下丘腦和垂體來調(diào)節(jié)食欲和能量平衡，是一種能夠促進(jìn)食欲的激素。對定期飼喂的Suffolk母羊進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在即將飼喂前Ghrelin 水平短暫激增，餐后幾分鐘內(nèi)Ghrelin水平又迅速降低［14］，該結(jié)果表明反芻動(dòng)物饑餓時(shí)Ghrelin 水平升高，可能和增加食欲有關(guān)。給未成熟母綿羊腦室輸注Ghrelin可增加下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）mRNA 表達(dá)及其多肽免疫活性物質(zhì)量［15］。由于神經(jīng)肽Y 被經(jīng)典地歸于能夠促進(jìn)食欲的激素，因此Ghrelin和神經(jīng)肽Y在調(diào)節(jié)食欲方面可能存在相互的間接調(diào)控作用。然而，在4周齡代乳料飼喂羔羊餐后盡管血漿GH 改變，但是Ghrelin水平?jīng)]有變化，在13 周齡苜蓿顆粒飼料飼喂羔羊餐后血漿GH 和Ghrelin水平均沒有變化［16］，該研究結(jié)果對在羊Ghrelin是否具有調(diào)控食欲提出了質(zhì)疑。在此值得一提的是我們曾經(jīng)給饑餓24h后的8頭7月齡荷斯坦公牛飼喂常規(guī)精料，用放射免疫法測定血漿Ghrelin水平，并沒有發(fā)現(xiàn)在飼喂前后Ghrelin 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（該結(jié)果未發(fā)表），因此，我們認(rèn)為在反芻動(dòng)物Ghrelin水平是否真的具有調(diào)控食欲的功能值得進(jìn)一步探討。在禁食公牛靜脈注射bGhrelins可升高血漿GH 水平但不影響血漿胰島素、血糖和游離脂肪酸（NEFA）水平［17］。去勢Suffolk公羊在禁食和飼喂?fàn)顟B(tài)下，Ghrelin對葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌分別具有抑制和促進(jìn)作用［18］。公羊在飼喂后3h 靜脈輸注羊Ghrelin可增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌［12］。這些結(jié)果提示Ghrelin可能參與調(diào)控機(jī)體的能量代謝，也存在通過對食欲的調(diào)節(jié)來發(fā)揮對能量平衡的調(diào)節(jié)作用。

2.3 對生殖和泌乳的調(diào)控

我國研究人員對反芻動(dòng)物Ghrelin功能的研究相對較少，主要集中在其對反芻動(dòng)物生殖功能的影響。杜晨光等［19］報(bào)道綿羊發(fā)情期黃體細(xì)胞的Ghrelin免疫活性遠(yuǎn)強(qiáng)于其前身壁顆粒細(xì)胞，而且Ghrelin mRNA 相對表達(dá)量也顯著高于其前身壁顆粒細(xì)胞，表明Ghrelin對于黃體功能具有潛在調(diào)控作用。Ghrelin基因或其多肽在反芻動(dòng)物生殖系統(tǒng)均被檢測到［6］，表明Ghrelin可能與生殖周期和妊娠的調(diào)節(jié)有重要關(guān)系。在哺乳期的薩能奶山羊（40.6kg±2.8kg）乳腺組織中，能夠穩(wěn)定的檢測到Ghrelin和GHSR-1a的mRNA，并且Ghrelin、GHS-R1a和β-酪蛋白的表達(dá)模式非常相似，在哺乳期中產(chǎn)奶量最高時(shí)（60d～120d）表達(dá)量最高，在產(chǎn)奶量最低時(shí)（180d）表達(dá)量最低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Ghrelin在培養(yǎng)的乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞能夠劑量依賴性的促進(jìn)β-酪蛋白的表達(dá)，并且能夠被D-Lys3-GHRP6控制［20］，這說明Ghrelin可能具有通過GHSR-1a調(diào)控反芻動(dòng)物乳腺的功能。

3 反芻動(dòng)物Ghrelin分泌的調(diào)節(jié)

3.1 攝食對Ghrelin分泌的調(diào)節(jié)

Ghrelin的發(fā)現(xiàn)和研究在學(xué)術(shù)界被重視，其重要的一個(gè)原因是發(fā)現(xiàn)在單胃動(dòng)物攝食可影響Ghrelin水平，進(jìn)而其被歸類到調(diào)節(jié)食欲激素范疇，那么在反芻動(dòng)物研究結(jié)果如何？Sheahan A J等［21］報(bào)道飼喂后多胎奶牛Ghrelin水平下降。在成年的奶牛，血漿Ghrelin 濃度在飼喂后下降，但是這種下降在3月齡的小母牛不明顯［22］。同樣，在斷奶前后荷斯坦小公牛餐后Ghrelin水平下降，注射揮發(fā)性脂肪酸顯著降低循環(huán)Ghrelin水平［23］。在公牛飼喂前血漿Ghrelin水平高于飼喂后，而且禁食組血漿Ghrelin水平明顯高于飼喂組［17］。公牛在生長期給予高能量的飼料在屠宰前測定血漿Ghrelin水平高于給予低能量飼料的；當(dāng)攝入能量相同時(shí)，干物質(zhì)攝入并不影響公牛血漿Ghrelin水平［25］。荷斯坦母牛在飼喂前30min和飼喂后30min檢測發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈和門靜脈的血漿Ghrelin濃度飼喂后比飼喂前低；并且在每天飼喂2次的組飼喂前Ghrelin的峰值高于每天飼喂4次的組［26］。這些研究表明攝食可能影響反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌，同時(shí)Ghrelin的水平也會(huì)因?yàn)轱曫B(yǎng)方案的改變而改變。

3.2 Ghrelin分泌的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)

動(dòng)物有機(jī)體是一個(gè)統(tǒng)一的整體，既然Ghrelin可影響其它激素的分泌，內(nèi)分泌系統(tǒng)也可能調(diào)控Ghrelin的分泌。Yannaing S等［27］研究報(bào)道給7月齡的荷斯坦去勢公牛（243kg±7kg）靜脈注射10 μg／kg體重硫酸化膽囊收縮素-8（sCCK-8），注射后血漿?；疓hrelin 比注射前增高并在注射后60 min達(dá)到峰值。同樣在荷斯坦去勢公牛靜脈注射內(nèi)皮素，檢測到血漿?；疓hrelin、總Ghrelin和GH的濃度均增加，并且該過程可能是通過內(nèi)皮素B 受體亞型介導(dǎo)的［28］。荷斯坦去勢公牛靜脈注射牛硫酸化胃泌素顯著地上調(diào)?；疓hrelin、總Ghrelin和GH 的血漿水平，并呈劑量依賴性關(guān)系［29］，而給這些牛靜脈注射蛙皮樣肽［BLPs，包括神經(jīng)介素C（NMC）、神經(jīng)介素B（NMB）和胃泌激素釋放肽（GRP）］發(fā)現(xiàn)任何一種蛙皮樣肽對Ghrelin的水平都沒有影響［30］。2周歲的去勢公羊在48h禁食后靜脈輸注牛胰多肽（PP）180 min，在160、170、180 min時(shí)可降低血漿Ghrelin水平［31］。用膽堿能受體阻斷劑和激動(dòng)劑證明膽堿能活性能夠抑制公羊Ghrelin的分泌［32］，可見膽堿能神經(jīng)元可能調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌。在切除卵巢并第三腦室輸注雌激素的母羊證實(shí)Ghrelin的分泌具有季節(jié)依賴性并受到光周期的調(diào)節(jié)，并且瘦素是Ghrelin分泌的重要因素［33］。以上研究結(jié)果表明膽囊收縮素、內(nèi)皮素、胃泌素、胰多肽和乙酰膽堿等激素均可調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌，但是這些激素調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin分泌的機(jī)制以及還有哪些激素能夠調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌值得進(jìn)一步探究。

4 總結(jié)

從Ghrelin 發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有十余年，隨著對Ghrelin及其受體對人或動(dòng)物的生長、能量代謝、攝食、消化道、心肺和免疫功能影響的揭示，Ghrelin的研究已經(jīng)成為內(nèi)分泌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Ghrelin的大多數(shù)研究主要集中在人或鼠類，而對于家畜，尤其是反芻動(dòng)物的研究較少，甚至罕見關(guān)于反芻動(dòng)物Ghrelin受體的研究報(bào)道。其次，Ghrelin或其類似物將來是否可能作為飼料添加劑調(diào)控動(dòng)物攝食和生長，在反芻動(dòng)物Ghrelin水平是否真的就能夠作為食欲高低的一個(gè)指標(biāo)這些均有待于進(jìn)一步探討。因此，針對反芻動(dòng)物的Ghrelin及其受體功能更廣泛和深入的研究具有重要的理論和生產(chǎn)實(shí)踐意義。

［1］Nass R M，Gaylinn B D，Rogol A D，et al.Ghrelin and growth hormone：story in reverse［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（19）：8501-8502.

［2］Kojima M.The discovery of ghrelin a personal memory［J］.Regul Pept，2008，145（1-3）：2-6.

［3］ThidarMyint H，Yoshida H，Ito T，et al.Dose-dependent response of plasma ghrelin and growth hormone concentrations to bovine ghrelin in Holstein heifers［J］.J Endocrinol，2006，189（3）：655-664.

［4］Huang Z G，Xiong L，Liu Z S，et al.The tissue distribution and developmental changes of ghrelin mRNA expression in sheep［J］.Yi Chuan Xue Bao，2006，33（9）：808-813.

［5］Aydin S.Presence of adropin，nesfatin-1，apelin-12，ghrelins and salusins peptides in the milk，cheese whey and plasma of dairy cows［J］.Peptides，2013（in press）.

［6］呂東媛.Ghrelin在烏珠穆沁羊雌性生殖道內(nèi)的表達(dá)及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建［D］.內(nèi)蒙古呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［7］Du C，Li H，Cao G，et al.Expression of the orexigenic peptide ghrelin and the type 1agrowth hormone secretagogue receptor in sheep oocytes and pre-implantation embryos produced in vitro［J］.Reprod Domest Anim，2010，45（1）：92-98.

［8］Du C，Xilingaowa，Cao G，et al.Expression of the orexigenic peptide ghrelin in the sheep ovary［J］.Domest Anim Endocrinol，2009，36（2）：89-98.

［9］Hashizume T，Horiuchi M，Nonaka S，et al.Effects of ghrelin on growth hormone secretionin vivoin ruminants［J］.Regul Pept，2005，126（1-2）：61-65.

［10］ThidarMyint H，Yoshida H，Ito T，et al.Combined administration of ghrelin and GHRH synergistically stimulates GH release in Holstein preweaning calves［J］.Domest Anim Endocrinol，2008，34（1）：118-123.

［11］張文龍.Ghrelin對莎能奶山羊下丘腦GHRH 和SSmRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（11）：46-50.

［12］Takahashi H，Kurose Y，Kobayashi S，et al.Ghrelin enhances glucose-induced insulin secretion in scheduled meal-fed sheep［J］.J Endocrinol，2006，189（1）：67-75.

［13］Thidar Myint H，Kuwayama H.Role for des-acyl ghrelin in the responsiveness of plasma hormones and metabolites to ghrelin in Holstein steers［J］.Domest Anim Endocrinol，2008，35（2）：190-197.

［14］Sugino T，Hasegawa Y，Kikkawa Y，et al.A transient ghrelin surge occurs just before feeding in a scheduled meal-fed sheep［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，295（2）：255-260.

［15］Polkowska J，Gajewska A，Wańkowska M，et al.The effect of intracerebroventricular infusions of ghrelin or short fasting on the gene expression and immunoreactivity of neuropeptide Y in the hypothalamic neurons in prepubertal female lambs：a morphofunctional study［J］.J Chem Neuroanat，2012，46（1-2）：45-50.

［16］Kobayashi Y，Onodera M，Yoshida M，et al.Postprandial changes in plasma concentrations of growth hormone and ghrelin around weaning in the goat［J］.Gen Comp Endocrinol，2006，148（3）：368-374.

［17］Wertz-Lutz A E，Knight T J，Pritchard R H，et al.Circulating ghrelin concentrations fluctuate relative to nutritional status and influence feeding behavior in cattle［J］.J Anim Sci，2006，84（12）：3285-3300.

［18］Takahashi H，Kurose Y，Sakaida M，et al.Ghrelin differentially modulates glucose-induced insulin secretion according to feeding status in sheep［J］.J Endocrinol，2007，194（3）：621-625.

［19］杜晨光，趙林旺，張小宇，等.Ghrelin在綿羊黃體形成過程中的表達(dá)［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（1）：16-19.

［20］Zhang W，Yu G，Huang Y，et al.Expression of ghrelin and GHSR-1ain mammary glands of dairy goat during the lactation and the effects of ghrelin on regulation of mammary functionin vitro［J］.Mol Cell Endocrinol，2013（in press）.

［21］Sheahan A J，Boston R C，Roche J R.Diurnal patterns of grazing behavior and humoral factors in supplemented dairy cow s［J］.J Dairy Sci，2013（in press）.

［22］Miura H，Tsuchiya N，Sasaki I，et al.Changes in plasma ghrelin and growth hormone concentrations in mature Holstein cows and three-month-old calves ［J］.J Anim Sci，2004，82（5）：1329-1333.

［23］Fukumori R，Mita T，Sugino T，et al.Effects of glucose and volatile fatty acids on blood ghrelin concentrations in calves before and after weaning［J］.J Anim Sci，2012，90（13）：4839-4845.

［24］Jennings J S，Wertz-Lutz A E，Pritchard R H，et al.Circulating ghrelin and leptin concentrations and growth hormone secretagogue receptor abundance in liver，muscle，and adipose tissue of beef cattle exhibiting differences in composition of gain［J］.J Anim Sci，2011，89（12）：3954-3972.

［25］Wertz-Lutz A E，Jennings J S，Clapper J A.Plasma ghrelin concentrations of beef cattle consuming a similar amount of dietary energy supplied by different ingredients［J］.J Anim Sci，2010，88（7）：2289-2299.

［26］Sugino T，Yamaura J，Yamagishi M，et al.A transient surge of ghrelin secretion before feeding is modified by different feeding regimens in sheep［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，298（5）：785-788.

［27］Yannaing S，Thidarmyint H，Zhao H，et al.Sulfated cholecystokinin-8increases ghrelin secretion but does not affect oxyntomodulin in Holstein steers［J］.Anim Sci J，2012，83（8）：577-584.

［28］Zhao H，Thanthan S，Yannaing S，et al.Involvement of endothelin B receptors in the endothelin-3-induced increase of ghrelin and growth hormone in Holstein steers［J］.Peptides，2010，31（5）：938-943.

［29］Zhao H，Yannaing S，Thanthan S，et al.Sulfated gastrin stimulates ghrelin and growth hormone release but inhibits insulin secretion in cattle［J］.Peptides，2011，32（11）：2218-2224.

［30］Zhao H，Matsuda S，Thanthan S，et al.Bombesin-like peptides stimulate growth hormone secretion mediated by the gastrin-releasing peptide receptor in cattle ［J］.Peptides，2012，37（2）：194-199.

［31］Takahashi H，Kurose Y，Suzuki Y，et al.Changes in blood pancreatic polypeptide and ghrelin concentrations in response to feeding in sheep［J］.J Anim Sci，2010，88（6）：2103-2107.

［32］Sugino T，Yamaura J，Yamagishi M，et al.Involvement of cholinergic neurons in the regulation of the ghrelin secretory response to feedingin sheep［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，304（2）：308-312.

［33］Kirsz K，Szczesna M，Molik E，et al.Seasonal changes in the interactions among leptin，ghrelin，and orexin in sheep［J］.J Anim Sci，2012，90（8）：2524-2531.