UFLC測(cè)定護(hù)肝膠囊中五味子甲素的含量

馬福家 司曉莉 曾曉娟

（中國人民解放軍第四五五醫(yī)院藥劑科 上海 200052）

護(hù)肝膠囊由藥典收載品種護(hù)肝片改造工藝而來，制劑處方由柴胡、五味子等組成，具有疏肝理氣，健脾消食，降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，用于慢性肝炎、遷延性肝炎及早期肝硬化等[1]。五味子，俗稱山花椒、秤砣子、藥五味子、面藤、五梅子等，《新修本草》載“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故有五味子之名。《中國藥典》2010版采用高效液相色譜法測(cè)定五味子甲素的含量來控制五味子的質(zhì)量，中成藥中五味子甲素的含量測(cè)定方法已有報(bào)道[2-3]，但對(duì)護(hù)肝膠囊中五味子甲素的含量測(cè)定鮮有報(bào)道?，F(xiàn)對(duì)制劑中五味子甲素含量進(jìn)行測(cè)定以控制護(hù)肝膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UFLC-20AD超快速液相色譜儀、PAD檢測(cè)器MB20A、LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；BP211D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋(南通通海電器廠)。

1.2 試藥

五味子甲素對(duì)照品（購自中國藥品生物制品檢定所）；水為娃哈哈純凈水；實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑除高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；護(hù)肝膠囊由吉林修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，陰性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

色 譜 柱：Agilent SB C18(100 mm×4.6 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相： 水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B；梯度洗脫：0～3 min(B ：55%)，3～15 min(B ：55%～20%)，15～15.1 min(B：20%～0)，15.1～17 min( B：0)；流速：0.4 ml/min；柱溫：40 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng) ：250 nm ；進(jìn)樣量 2 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取五味子甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含五味子甲素48.9 μg的對(duì)照品溶液， 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取護(hù)肝膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的乙酸乙酯25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 ml，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方組成比例制備缺五味子陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法，制備五味子陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

吸取五味子甲素對(duì)照品溶液、護(hù)肝膠囊供試品溶液及缺五味子的陰性對(duì)照品溶液各10 μl，注入超高速液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在與五味子甲素對(duì)照品峰相同的保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，說明處方中其他味藥對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，結(jié)果見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1、5、10、15、20μl，注入超高速液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，五味子甲素的回歸方程為：Y=37 960X+93 183（r=0.999 8），表明五味子甲素進(jìn)樣量分別在0.016～0.323 μg/μl范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量5 μl，測(cè)定峰面積值，計(jì)算五味子甲素峰面積的RSD=0.80(n=5)。結(jié)果表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品(批號(hào)110901)10 ml，按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣1次，考察精密度(RSD=0.60，n=5)，結(jié)果供試品溶液中五味子甲素在24 h內(nèi)峰面積無明顯變化。

圖1 護(hù)肝膠囊及對(duì)照品UFLC圖

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取護(hù)肝膠囊樣品(批號(hào)：110901)5份，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品供試液，按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果五味子甲素平均含量為0.373 827 mg/g，RSD為3.20(n=5)， 表明此法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的樣品(批號(hào)110901) 5份，每份5 ml，分別準(zhǔn)確加入對(duì)照品溶液五味子甲素（16.3 μg/ml）8 ml。按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按其項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。五味子甲素平均回收率(n=5)為96.5%，RSD為2.5。試驗(yàn)結(jié)果表明加樣回收率良好。

2.11 樣品測(cè)定

取3批護(hù)肝膠囊(批號(hào)分別為091103、110802、081101)，照上述方法測(cè)定護(hù)肝膠囊中五味子甲素的含量，結(jié)果見表1。

表1 三批護(hù)肝膠囊樣品的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討論

護(hù)肝膠囊中五味子具有氣陰雙補(bǔ)，養(yǎng)肝護(hù)肝之效。其中五味子甲素為主要有效成分，因此測(cè)定護(hù)肝膠囊中五味子甲素的主要含量，對(duì)更好地控制護(hù)肝膠囊的內(nèi)在質(zhì)量具有重要意義。

在流動(dòng)相的選擇上，我們?cè)捎盟幍渲械牧鲃?dòng)相即甲醇-水(63：37）。但分離效果不是很好，故選用了乙睛-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的方法，五味子甲素與其它雜質(zhì)峰分離良好。

在儀器使用上，本文所采用的超快速液相色譜。超快速液相色譜(ultra fast liquid chromatography，UFLC)是近年來出現(xiàn)的新技術(shù)，其色譜柱選用1.8 μm粒度的C18填料，因此可獲得更高的柱效，并在更寬的線速度范圍內(nèi)能保持柱效恒定，有利于提高流動(dòng)相流速、節(jié)省分析時(shí)間和增加峰容量。與HPLC相比，UFLC具有超高分離度、超高速度和超高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，因而適于成分復(fù)雜的中藥等樣品的分離。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010: 760-761.

[2]沙美,史道芬,歐陽強(qiáng).高效液相色譜法測(cè)定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(7): 1671-1672．

[3]杜英峰,袁志芳,王春英,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量[J].藥物分析,2004,24(4): 397-399.