響應面法優(yōu)化水酶法提取林蛙卵蛋白

季曉楓， 林 鳳， 邱芳萍＊

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012；2.吉林大學生命科學學院，吉林長春 130012）

0 引 言

林蛙是水陸兩棲動物，常在沒有強烈光照、濕潤涼爽的環(huán)境中生活，以多種昆蟲為食，9月下旬至10月初從山坡林區(qū)遷到河溝附近，陸續(xù)進入水底集群冬眠。少數(shù)在泥間或樹根下越冬，次年清明前后復蘇。林蛙渾身是寶，且可直接食用，關(guān)于林蛙油的研究報道很多，但對林蛙卵的研究和報道甚少。有報道林蛙卵富含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、氨基酸及雄性激素睪丸酮、雌性激素孕酮、雌二醇、雌三醇和磷脂等。它具有提高免疫力、調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老、預防婦女更年期綜合癥等功效［1－4］。以林蛙卵為原料，利用響應面法對最佳酶解條件進行了分析，為林蛙卵的開發(fā)及利用提供了理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮林蛙卵，購于吉林省靖宇縣；

堿性蛋白酶，活力1.2×105U／mL；

LDZ5-2型臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；

二十孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；

KDN-04Ш型蛋白質(zhì)測定儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析檢測方法

水分的測定：依據(jù)GB5009.3-2010。

粗脂肪的測定：依據(jù)GB／T14772-2008。

粗蛋白的測定：依據(jù)GB5009.5-2010。

灰分測定：依據(jù)GB／T5505-2008。

1.2.2 工藝流程

新鮮林蛙卵→干燥粉碎→配液→調(diào)pH和溫度→蛋白酶酶解→升溫滅酶→過濾得殘渣→測殘蛋白→調(diào)pH和溫度→活性炭脫色→過濾→離心分離→水解液噴霧干燥。

1.2.3 操作要點

取50g新鮮林蛙卵粉干燥粉碎，按一定比例加入蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中并利用攪拌器進行不斷攪拌，用稀釋的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，并加入一定量的堿性蛋白酶，在恒溫下進行酶解，經(jīng)過一定時間后，升溫至100℃滅酶5min，過濾殘渣，最后進行離心分離，得水解液，噴霧干燥得到林蛙卵蛋白。林蛙卵蛋白提取率計算如下：

1.2.4 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的單因素實驗

1）加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比分別為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量分別選取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%。

2）溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度分別為40，45，50，55，60，65℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量選取2%。

3）時間對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0h，pH值為9，加酶量選取2%。

4）料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比分別為1∶3，1∶4，1∶5， 1∶6，1∶7，1∶8，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量選取2%。

5）pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值分別為7，8，9，10，11，12，加酶量選取2%。

1.2.5 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定了各因素的水平值范圍，并采用響應面中心組和試驗設計，研究各酶解參數(shù)對考察指標的影響規(guī)律。選取加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比和酶解pH值5個因素為自變量，以林蛙卵蛋白提取率為響應值，優(yōu)化林蛙卵蛋白提取工藝的最佳參數(shù)。其因素水平編碼表見表1。

表1 響應面設計因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用design expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析［5－6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 林蛙卵的主要成分

本實驗用林蛙卵的主要成分見表2。

表2 林蛙卵成分分析表 %

2.2 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的單因素實驗結(jié)果

加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響

加酶量低于2%時，隨著加酶量的增加，提取率顯著上升，當加酶量達到2%時，提取率接近最大值，超過2%時，提取率的變化不明顯，趨于穩(wěn)定。由于酶的價格比較昂貴，考慮到經(jīng)濟效益，在提取率近乎相等的條件下，最佳的加酶量為2%。

酶解溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 酶解溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響

在溫度低于55℃時，林蛙卵蛋白提取率隨著溫度的升高而增加，主要由于溫度越來越接近酶的最適溫度，酶的活性增加，酶對底物的作用明顯，因此，提取率隨著溫度的升高而增加，當溫度高于55℃時，提取率隨著溫度的升高而降低，因此最適溫度為55℃。

酶解時間對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間對林蛙卵蛋白提取率的影響

當時間低于4.0h時，提取率呈上升趨勢，變化程度較明顯，時間繼續(xù)增加時，提取率緩慢增加而后又略有降低，從時間合理化的出發(fā)點考慮最適酶解時間為4.0h。

料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響

隨著料液比的降低，提取率先升高而后下降，在1∶5時出現(xiàn)峰值。因此最適料液比為1∶5。

pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，當pH值低于9時，隨著pH值的增加，提取率逐漸增加，當pH值為9時，提取率接近最高值，但隨著體系pH值增大，雖然提取率增加，但會帶入過多的堿，使所得的蛋白含鹽量增加，給蛋白的進一步利用帶來限制。因此最適宜的pH值為9。

圖5 pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響

2.3 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎上，綜合考慮經(jīng)濟效益及林蛙卵蛋白品質(zhì)，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應面中心組和試驗設計，研究各酶解參數(shù)對考察指標的影響規(guī)律，并得到酶解的最佳條件［7］。以各酶解工藝參數(shù)加酶量A、酶解溫度B、酶解時間C、料液比D、pH值E為自變量，以提取率為響應值。響應面實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 響應方案及結(jié)果

續(xù)表3

2.4 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗結(jié)果分析

通過統(tǒng)計分析軟件design expert進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應面回歸模型如下：

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，響應曲面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4。

表4 回歸與方差分析結(jié)果

由表4可知，AB，AC，AD，CD，DE，CE模型顯著，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項不顯著，并且該模型R2＝99.92%，R2Adj＝99.86%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，試驗誤差小，可以用該方程代替真實試驗點進行分析。按照得到的數(shù)學模型繪制響應曲面，如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對提取林蛙卵蛋白提取率影響的響應面

2.5 條件優(yōu)化

由F檢驗可以得到因子貢獻率為：A＞D＞B＞C＞E，即加酶量＞料液比＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值。利用響應面軟件對邊界值和求得的極值進行分析，得到最佳提取條件為：加酶量1.9%，溫度58℃，酶解時間4h，料液比1∶5，pH值8.8。在響應面分析法求得的最佳條件下進行平行實驗（3次），平均值為9.63%。響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預測實際林蛙卵蛋白提取率情況［8］。

3 結(jié) 語

本試驗選用堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白，利用響應面進行優(yōu)化，使得林蛙卵蛋白的提取率達到最佳。本試驗為校企合作研制和開發(fā)林蛙卵蛋白的相關(guān)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)，為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。本研究將從更大的深度上挖掘長白山林蛙資源，開發(fā)新的終端產(chǎn)品，增加林蛙加工品種，促進長白山林蛙亞種產(chǎn)業(yè)系的現(xiàn)代化、高值化發(fā)展。

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