周 瑜，楊寶田

林蛙又稱棕色蛙(Brown Frog)，隸屬于無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)，主要分布于歐亞大陸溫帶地區(qū)至中國、印度一帶和北美南部地區(qū)［1］。中國的林蛙物種資源豐富，包括中國林蛙種組(Rana chensinensis species group)、長肢林蛙種組(Rana longicrus species group)和黑龍江林蛙種組(Rana amurensis species group)［2］。中國分布的林蛙屬物種約有17個，包括近年發(fā)表的新種徂徠林蛙(Rana culaiensis)［3］、貓兒山林蛙(Rana maoershanensis)［4］和 Rana jiemuxiensis［5］。

由于形態(tài)特征的相似性，林蛙屬各物種的識別較為困難［6］。近年來，隨著DNA序列分析技術的迅速發(fā)展，其在物種和個體識別、親緣關系鑒定以及分子進化和系統(tǒng)發(fā)育關系分析等諸多方面顯示了極大的優(yōu)勢，從而得到了廣泛的應用。由于母系遺傳和不存在重組過程的特點，線粒體DNA在很多動物研究中被證明能夠很好地展現(xiàn)物種系統(tǒng)發(fā)生關系［7］。在對林蛙屬物種的遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)生關系研究中，線粒體DNA細胞色素b(Cyt b)基因都被視為很好的指示序列［8］。細胞色素氧化酶I(COI)基因作為DNA條形碼標識序列，在兩棲類物種鑒定方面也得到廣泛關注［9－10］。中國林蛙屬物種關系復雜，前人的相關研究主要集中在對某一個種組內部的系統(tǒng)發(fā)生關系的分析，包括近年新發(fā)現(xiàn)物種在內的較全面的系統(tǒng)發(fā)生關系有待進一步研究。

本研究應用Cyt b基因和COI基因序列分析對林蛙屬物種進行研究，評價相關物種的有效性，全面分析中國分布林蛙屬物種的系統(tǒng)發(fā)生關系。

1 材料與方法

1.1 樣本收集、基因組提取與PCR擴增

本研究所收集的中國分布的林蛙屬物種樣本及來源見表1。樣本從野外采集經鑒定后取肌肉或肝臟組織置于75%乙醇保存?zhèn)溆?。采用SDS/蛋白酶K裂解，酚－氯仿抽提法提取組織中的總DNA［11］。

R .kunyuensis SYNU07050112 Mt.Kunyu，Shandong，China KF020609 KF020624 SYNU07050130 Mt.Kunyu，Shandong，China KF020610 KF020625 R.chensinensis KIZRD05SHX01 Huxian，Shaanxi JF939080 JN984335 SYNU－h(huán)ld1 Huludao，Liaoning KF020612 KF020627 R.dybowskii KIZ070423448 Huangnihe，Jilin JF939078 JF939116 SYNU07040020 Huanren，Liaoning Unpublished Unpublished SYNU13070055 Xiuyan，Liaoning Unpublished Unpublished SYNU13070053 Mt.Guanmenshan，Liaoning Unpublished Unpublished R.huanrensis SYNU040006 Huanren，Liaoning JF939072 JN984545 SYNU07040035 Huanren，Liaoning Unpublished KF204668 R.kukunoris CJ06102001 Qinghai Lake，Qinghai JF939073 JN984213 Outgroup Pelophylax nigromaculatus AB043889 Lithobates catesbeianus AB761267

PCR 擴增引物參考 Zhou 等(2012)［12］，Tanaka－Ueno 等(1999)［13］，Che 等(2012)［9］(表 2)。PCR 擴增反應總體積為25μl。反應條件:94℃預變性5min，然后進行94℃變性30s、46℃退火30s、72℃延伸60s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產物由北京六合華大基因有限公司進行雙向測序，以確保序列的準確性。

1.2 DNA序列數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)發(fā)育分析

所測得序列用DNAStar 7.0進行雙向測序結果的拼接及序列校對，并結合由Yan等(2011)［5］發(fā)表的數(shù)據(jù)資源，使用ClustalX 1.81軟件［14］進行多重序列比對。將兩個基因片段合并一起進行分析。p－distance計算使用 MEGA5.1 軟件［15］。

以GenBank數(shù)據(jù)庫中黑斑側褶蛙(Pelophylax nigromaculatus)和美國牛蛙(Lithobates catesbeianus)為外群［16－17］，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)分別對線粒體基因構建分子系統(tǒng)樹。用RAxML 7.0.4軟件［18］執(zhí)行rapid－h(huán)ill－climbing運算法則構建ML樹，并進行1000次擬重復抽樣的bootstrap分析，以檢驗各節(jié)點的置信度。用MrBayes 3.1.2［19］軟件構建貝葉斯樹，以隨機樹為起始樹，4條馬爾可夫鏈運行1000萬代，每1000代抽樣并保存數(shù)據(jù)一次，舍棄老化25%樣本后，根據(jù)剩余樣本構建合意樹。分析過程中對兩個基因片段分別按第一密碼子、第二密碼子和第三密碼子使用獨立模型進行分析。ML樹采用GTRCAT模型，BI樹的最佳堿基替換模型由 MrModeltest 2.3［20］軟件分析得出表3。

表2 引物序列

表3 使用MrModeltest軟件分析得到的各分區(qū)數(shù)據(jù)ACI堿基替代模型

2 結果

2.1 序列分析

實驗測得Cyt b基因片段長度≥629bp，COI基因片段長度～560bp。Kartavtsev和 Lee(2006)［21］基于大量樣本分析了Cyt b基因片段與COI基因片段在種內、近緣物種之間、屬內各物種間及屬間的p－distance變化范圍。其中近緣物種間的p－distance值為Cyt b:5.52±1.34，COI:4.91±0.83。為了探討中國分布的林蛙物種種間關系，我們也對Cyt b基因和COI基因片段序列數(shù)據(jù)進行了種間p－distance分析(表4)。分析結果顯示，除徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙之間的p－distance(Cytb:2.7;COI:2.7)和徂徠林蛙與長肢林蛙COI基因間p－distance(COI:3)較低外，其余中國分布林蛙屬物種種間p－distance大于近緣物種之間p－distance(Cytb:4.9～24.2;COI:4.4 ～23.3)。徂徠林蛙與長肢林蛙 p－distance值介于 Kartavtsev和 Lee(2006)［21］分析的種內與相近物種之間。貓兒山林蛙與其他林蛙屬物種的p－distance結果顯示，貓兒山林蛙與長肢林蛙種組物種關系較近，最近為昭覺林蛙。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

分析構建的ML樹和BI樹的拓撲結構基本一致(圖1)。從圖1中可以看出:(1)除徂徠林蛙(Bayesian posterior probabilities，PP=0.73;bootstrap values，BS=0.79)外，其他林蛙物種的單系性均得到了肯定(PP=1.0;BS=1.0);(2)3個林蛙種組中黑龍江林蛙種組與中國林蛙種組的單系性得到支持(PP=1.0;BS=1.0)，除貓兒山林蛙以外的長肢林蛙種組單系性也得到支持(PP=1.0;BS=1.0);(3)系統(tǒng)發(fā)育樹還顯示貓兒山林蛙與黑龍江林蛙種組構成姊妹群，但支持度較低(PP=0.52;BS=0.28)。

ML樹與BI樹結構的不同之處為:(1)ML樹顯示3個種組間關系為中國林蛙種組與黑龍江林蛙種組加貓兒山林蛙組成的群系首先構成姊妹群，再與長肢林蛙種組合并，而在BI樹中這3個并列支系構成了多歧樹;(2)在長肢林蛙種組中，ML樹由徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和長肢林蛙構成的支系先與R.jiemuxiensis結合，再與由峨眉林蛙和寒露林蛙構成的支系結合。BI系統(tǒng)樹則為R.jiemuxiensis與上述兩個支系構成并系的多歧樹。

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圖1 基于線粒體COI基因和Cyt b基因聯(lián)合分析的ML樹(圖左)和貝葉斯樹(圖右)

3 討論

3.1 物種有效性評價

基于COI和Cyt b基因片段的林蛙屬物種間遺傳距離分析結果表明，除徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙間p－distance值較小外，其余林蛙物種間p－distance值均大于Kartavtsev and Lee(2006)界定的種間p－distance值。系統(tǒng)發(fā)育樹也證實，除徂徠林蛙外，其余林蛙物種的單系性得到支持。所以研究認為徂徠林蛙的物種有效性和分類地位有待進一步全面與鎮(zhèn)海林蛙和長肢林蛙進行聯(lián)合評估，包括幾個新種在內的其余林蛙物種有效性均得到肯定。

貓兒山林蛙為Lu等(2007)［7］基于形態(tài)學分析發(fā)表的林蛙屬新物種，與長肢林蛙種組物種形態(tài)更為相似。Yang等(2010)［22］基于線粒體16SrRNA基因片段對其分析結果顯示，貓兒山林蛙與中國林蛙互為姊妹群。Yan等(2011)［5］對長肢林蛙種組物種進行全面分析，結果顯示采自貓兒山地區(qū)的形態(tài)近似貓兒山林蛙的物種為寒露林蛙，并認為貓兒山林蛙為寒露林蛙的同物異名。我們的研究結果表明雖然貓兒山林蛙在系統(tǒng)發(fā)育樹中的地位沒有得到完全解決，但貓兒山林蛙與其他林蛙物種較大的p－distance(Cyt b:15.9－23.3;COI:13.7－19.6)和系統(tǒng)發(fā)育樹均證明其并不是寒露林蛙的同物異名物種，貓兒山林蛙為有效物種。

3.2 系統(tǒng)發(fā)生關系

中國林蛙種組的單系性得到支持。Zhou等(2012)［12］詳細研究了由中國林蛙、高原林蛙和桓仁林蛙組成的中國林蛙復合群(Rana chensinensis species complex)，中國林蛙復合群與東北林蛙構成姊妹支系。長肢林蛙種組的單系成立，但其內部物種的系統(tǒng)發(fā)生關系復雜。本研究分析結果得到長肢林蛙種組由(1)昭覺林蛙、(2)峨眉林蛙、(3)寒露林蛙、(4)R.jiemuxiensis和(5)徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和長肢林蛙5個亞支系構成，但5個亞支系間的系統(tǒng)發(fā)生關系沒能解決，有待進一步研究。黑龍江林蛙種組的單系性被支持，由黑龍江林蛙與昆崳林蛙構成的姊妹群組成。

貓兒山林蛙在系統(tǒng)發(fā)育樹中的地位雖與黑龍江林蛙種組較近，但是較大的p－distance值和系統(tǒng)樹中較低的節(jié)點支持度均表明貓兒山不屬于任何一個種組。其系統(tǒng)地位有待結合更大量的物種樣本和序列數(shù)據(jù)進一步分析。

4 結論

(1)盡管貓兒山林蛙的系統(tǒng)發(fā)生地位沒有得到完全解決，但其并不是寒露林蛙的同物異名物種，即貓兒山林蛙為有效物種。(2)中國林蛙種組、黑龍江林蛙種組和長肢林蛙種組的單系性得到肯定，長肢林蛙種組物種的系統(tǒng)發(fā)生關系有待進一步研究確定。

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