洪求枝 （長(zhǎng)江大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州434020）

標(biāo)記基因可為獲得真正的轉(zhuǎn)化體提供判斷依據(jù)，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物誕生以來，所有正在進(jìn)行的田間試驗(yàn)和被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因植物幾乎都含有標(biāo)記基因。然而，標(biāo)記基因在為轉(zhuǎn)基因植物篩選帶來便利的同時(shí)，有人擔(dān)心其表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生一定的影響。為此，筆者就轉(zhuǎn)基因植物中常用的標(biāo)記基因及其對(duì)土壤微生物潛在影響的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 標(biāo)記基因的研究

選擇標(biāo)記基因 （selectable marker gene）簡(jiǎn)稱標(biāo)記基因 （marker gene），是一些已知效應(yīng)的基因，它能夠使個(gè)體具備特定的特征并且通過生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)或分子生物學(xué)手段檢測(cè)其存在且效果明顯的基因，這些標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化過程中起到重要作用。目前絕大部分植物的轉(zhuǎn)基因需要融合標(biāo)記基因，以便于檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因研究中普遍應(yīng)用的抗性標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)化過程中是很有利的選擇工具，可大大減少區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的工作量。

1．1 常用的標(biāo)記基因及作用

根據(jù)標(biāo)記基因的功能，可將其分為選擇基因和報(bào)告基因2類［1］。選擇基因的編碼產(chǎn)物可使細(xì)胞或組織具有除草劑或抗生素的抗性，或者具有代謝優(yōu)越性。當(dāng)環(huán)境中存在抗生素或除草劑等選擇試劑時(shí)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植株能夠存活從而被篩選出來。報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、且不依賴于外界壓力的一類基因。目前常用的報(bào)告基因大多是一些酶基因，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 （cat）、熒光素酶基因 （luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因 （gus）等。

植物轉(zhuǎn)基因研究中使用較多的是選擇基因，選擇基因可以分為2類：即抗生素類選擇基因和抗除草劑類選擇基因［2］。

抗生素類選擇基因，如對(duì)卡那霉素、G28、巴龍霉素和新霉素有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt），氯霉素抗性的氯霉素乙轉(zhuǎn)移酶基因 （cat），鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 （Spt），潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 （aphV）及慶大霉素和博來霉素抗性基因等。其中卡那霉素抗性基因是在植物基因轉(zhuǎn)化上最早也最常用的顯性選擇標(biāo)記，潮霉素抗性基因也是目前較常用的標(biāo)記基因［1］。

卡那霉素抗性基因的標(biāo)記原理是以nptII基因作為遺傳標(biāo)記基因，該基因編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II能使植物產(chǎn)生抗卡那霉素特性［3］，故可用卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)化的植株進(jìn)行篩選，已報(bào)道的方法主要用在田間對(duì)棉花葉片涂抹卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)［4-8］。

潮霉素對(duì)應(yīng)的標(biāo)記基因主要為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 （aphⅣ），利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)法將重組基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞［9］。潮霉素抗性基因還可以分為aph（4）-Ia（或hph）基因及aph（4）-Ib（或hyg）基因，又稱hpt。實(shí)驗(yàn)證明hpt基因是單子葉植物較為理想的篩選基因，其優(yōu)點(diǎn)有：選擇效率高、基因型差異小、對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生毒害作用、再生的轉(zhuǎn)基因植株育性較好等［10］。目前，hpt基因在水稻、玉米和小麥等作物上有著廣泛應(yīng)用，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻的有關(guān)研究都以其為選擇標(biāo)記。

1．2 標(biāo)記基因的潛在風(fēng)險(xiǎn)

標(biāo)記基因在為轉(zhuǎn)化植株的篩選提供了方便，但選擇標(biāo)記基因在完成篩選、得到所需要的轉(zhuǎn)化植株之后失去了利用價(jià)值，甚至有潛在危害，其危害性主要包括食品和環(huán)境2方面：（1）食品安全性方面。標(biāo)記基因可能被轉(zhuǎn)入人與動(dòng)物的腸道微生物和上皮細(xì)胞，從而降低抗生素在臨床治療中的效用。標(biāo)記基因的表達(dá)產(chǎn)物也可能對(duì)人與動(dòng)物的肌體產(chǎn)生一定影響［11］。（2）環(huán)境安全方面。標(biāo)記基因涉及到的環(huán)境安全問題則主要有：編碼抗生素或除草劑的標(biāo)記基因可能發(fā)生漂移，進(jìn)入野生親緣種中，產(chǎn)生具有抗性的“超級(jí)雜草”。轉(zhuǎn)入標(biāo)記基因的植物可能對(duì)環(huán)境中其他動(dòng)植物產(chǎn)生選擇，從而改變生態(tài)組成，破壞生態(tài)平衡［12］。標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)環(huán)境中動(dòng)植物和微生物產(chǎn)生選擇，從而改變生態(tài)組成。標(biāo)記基因可能轉(zhuǎn)移到微生物中，導(dǎo)致土壤中超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。

1．3 解決標(biāo)記基因安全性問題途徑

可以通過回避或剔除標(biāo)記基因以及發(fā)展安全標(biāo)記基因等方法來解決標(biāo)記基因的安全性問題。之所以要剔除標(biāo)記基因，一方面是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物一旦再生成功，標(biāo)記基因便不再有用；另一方面，基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中一些輔助序列 （包括標(biāo)記基因）的消除可以減少同源區(qū)序列造成的遺傳不穩(wěn)定［13-15］。目前，比較有效的標(biāo)記基因剔除系統(tǒng)主要有：雙T-DNA載體共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)和染色體內(nèi)同源重組系統(tǒng)［16］。

安全標(biāo)記基因多來自于植物本身，不會(huì)破壞生態(tài)平衡。國(guó)內(nèi)有報(bào)道［17］磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因、木糖異構(gòu)酶基因、綠色熒光蛋白基因等6種基因可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗性標(biāo)記基因，實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化無害化。

2 標(biāo)記基因作物對(duì)土壤微生態(tài)的影響

土壤微生態(tài)系統(tǒng)包括土壤微生物種類與數(shù)量、土壤理化性質(zhì)、土壤養(yǎng)分的釋放及有效性等，是地球生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)與能量循環(huán)的重要場(chǎng)所與組成部分。有研究表明，改變土壤微生物群落將影響土壤微生物呼吸速率及其溫度敏感性，從而間接影響全球氣候變化趨勢(shì)［18-19］。也有研究證實(shí)標(biāo)記基因作物中轉(zhuǎn)Bt基因棉花和馬鈴薯的根系分泌物對(duì)其根際微生物在數(shù)量方面與對(duì)照間差異不顯著［20-22］。

2．1 標(biāo)記基因產(chǎn)物進(jìn)入土壤的途徑

標(biāo)記基因產(chǎn)物進(jìn)入土壤的途徑是多種多樣的，其中最直接的途徑包括植株殘茬分解、根系分泌以及花粉落入。這些進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)的標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物都可能對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響［23］，進(jìn)而對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

2．2 標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)土壤微生物群落的影響

土壤微生物是重要的分解者，將土壤中有機(jī)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為無機(jī)養(yǎng)分，以利于植物的吸收利用。合理利用土壤微生物可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、保護(hù)瀕危植物、恢復(fù)退化植被和修復(fù)被污染的土壤［24］。導(dǎo)入作物中的外源基因及其所表達(dá)的蛋白可通過作物殘?bào)w、根系脫落物和分泌物等進(jìn)入土壤，對(duì)土壤環(huán)境的生態(tài)平衡產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響，進(jìn)而影響土壤微生物、昆蟲、軟體動(dòng)物的分布等［25］。而植物基因轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記基因亦屬于外源基因，理論上也極有可能對(duì)土壤微生物造成影響，而且由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因育種仍然依賴于選擇標(biāo)記基因，故研究標(biāo)記基因?qū)ν寥牢⑸锏挠绊懹葹橹匾壳昂苌儆袌?bào)道研究這方面內(nèi)容，以前的研究依然集中在以轉(zhuǎn)基因玉米、棉花、水稻、大豆、油菜等植物個(gè)體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的水平上。因此，標(biāo)記基因?qū)ν寥牢⑸锏挠绊懹写M(jìn)一步地研究。

2．3 標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)土壤微生物種類和數(shù)量的影響

標(biāo)記基因會(huì)同目標(biāo)基因一起整合到植物基因組中，通過重組、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等途徑在微生物之間相互轉(zhuǎn)移。另外，標(biāo)記基因跟其他基因一樣，進(jìn)入植物基因組后，會(huì)破壞基因組的完整性，所以轉(zhuǎn)標(biāo)記基因的植株一般也會(huì)變小、花期延長(zhǎng)、育性一般也會(huì)降低。在地下部分，轉(zhuǎn)標(biāo)記基因的作物在根尖有時(shí)會(huì)有分泌物，這些分泌物可能會(huì)對(duì)土壤中的微生物造成影響，尤其是其種類和數(shù)量Donegan等［26］就轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因煙草對(duì)土壤微生物種類和數(shù)量的潛在影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物根際土壤中存在更多的線蟲，而Collembola的數(shù)量則顯著降低。

3 結(jié)語

篩選標(biāo)記在植物遺傳轉(zhuǎn)化中極為重要，但在完成篩選的使命后也可能給環(huán)境帶來不利的影響。通過研究標(biāo)記基因?qū)ν寥牢⑸锏挠绊憗砜疾炱渫寥拉h(huán)境安全性將有助于更好地了解標(biāo)記基因，更安全地應(yīng)用標(biāo)記基因，并為其應(yīng)用和使用后環(huán)境安全問題的解決提供參考，為轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模推廣應(yīng)用的安全評(píng)估提供基礎(chǔ)。

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