CD31在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

趙長祺，尹長江

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

甲狀腺癌是頭頸部比較常見的惡性腫瘤之一，其中，約半數(shù)以上患者為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary Thyroid Carcinoma,PTC)[1]。國內(nèi)外研究顯示，甲狀腺癌是多種因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)生的具體機(jī)制較為復(fù)雜，目前還尚未完全揭示。CD31，即血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(plateletendothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1),是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，在淋巴管和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)?，F(xiàn)有研究表明，CD31與甲狀腺癌組織的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[2]。本試驗(yàn)采用免疫組化和Western-Blot法檢測(cè)CD31在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常組織中的表達(dá)，探討CD31在甲狀腺乳頭狀癌臨床治療上的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 分別收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2009年9月至2010年8月的甲狀腺乳頭狀癌臨床標(biāo)本60例，癌周組織20例，年齡45-65歲，其中男性患者21例，女性患者39例，經(jīng)病理檢查證實(shí)均為原發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌。取臨床病理標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片，切片厚5μm，用于CD31免疫組織化學(xué)染色。取臨床病理標(biāo)本新鮮組織凍存于液氮中，用于蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.2 主要試劑 兔抗CD31多克隆抗體(美國Sigma公司);羊抗兔IgG二抗(美國Rockland公司);免疫組化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 CD31蛋白免疫組化檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織中CD31的表達(dá)情況。取臨床標(biāo)本石蠟切片梯度脫蠟水化后，以3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后進(jìn)行微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉20min后，依次經(jīng)兔抗CD31多克隆抗體4℃孵育過夜，羊抗兔IgG 37℃孵育30min，SABC 37℃孵育20min，然后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色5min，最后經(jīng)蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色或棕褐色染色者為CD31陽性，不著色者為陰性。

1.4 CD31蛋白印記雜交檢測(cè) 提取甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織總蛋白進(jìn)行蛋白濃度定量，一抗選用兔抗CD31多克隆抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Western-Blot法檢測(cè)甲狀腺癌及癌周組織CD31蛋白的表達(dá)水平。蛋白上樣量為40μg，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗振蕩孵育2h(一抗終濃度2μg/ml)，二抗溫和振蕩孵育1h，洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法顯影，暗室X光膠片曝光，采用Quantity One-v4.6.2軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析，并計(jì)算各待測(cè)條帶與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值比值，確定CD31蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)υ囼?yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異顯著性用方差分析法檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD31在甲狀腺癌組織中的表達(dá) 微血管處可見棕黃色的細(xì)顆粒狀染色，為CD31陽性反應(yīng)，其主要表達(dá)于甲狀腺癌周間質(zhì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中。CD31在甲狀腺癌組織中的陽性表達(dá)率為67.69±10.97%，明顯高于癌周組織的22.87±5.16%，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中CD31的相關(guān)性 對(duì)甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織CD31蛋白的Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CD31蛋白分子量約為130kD，與癌周組織相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中CD31蛋白的表達(dá)明顯升高。以各待測(cè)條帶與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，與癌周組織(0.26±0.03)相比，甲狀腺癌組織中CD31蛋白的相對(duì)表達(dá)(0.62±0.09)顯著上調(diào)。

3 討論

CD31是一種內(nèi)皮細(xì)胞連接分子，參與人體內(nèi)多種生理過程，其主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，拷貝數(shù)可達(dá)到106拷貝/細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞的重要標(biāo)記物[3]。現(xiàn)有的研究表明CD31參與了血管生成，在炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中均具有著重要的意義[4]。因此，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要標(biāo)記物，CD31在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展過程中直接反映了甲狀腺乳頭狀癌微血管的生成情況。本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，CD31在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)明顯升高，提示其可能在甲狀腺癌腫瘤微血管形成過程中起到一定的促進(jìn)作用，腫瘤內(nèi)血管生成增多，可增加腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。因此，本研究結(jié)果提示，CD31可能在甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移與CD31的表達(dá)密切相關(guān)，CD31的表達(dá)越高，腫瘤的轉(zhuǎn)移性越強(qiáng)，預(yù)后越差，所以，CD31可作為甲狀腺乳頭狀癌腫瘤轉(zhuǎn)移和病情進(jìn)展的重要信號(hào)。研究結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌中CD31表達(dá)水平有望成為判斷臨床療效和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

[1]徐銀峰,丁國芳,孫瑜,等.前列腺癌VEGFR-3和CD3表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,29(5):14-17.

[2]Hasan J,Byers R,Jayson GC.Intra-tumoural microvessel densit in human solid tumours[J].Br J Cancer,2002,86(10):1566-1577.

[3]Jacquemier J,Mathoulin-Portier MP,Valtola R,et al.Pro gnosis of breast carcinoma lymphangio-genesis evaluated b immunohistochemicnal investigation of vascular-endothelial growth- factor receptor 3[J].Int J Cancer,2000,89(1):69-73.

[4]Elaine S,Marcos RT,Alexandre MA,et al.Anglogenesis a indicator of metastatic potential in papillary thyroid carcinoma[J]Clinics,2005, 60(3):233-240.