鄔萌萌，譚曉風(fēng) ，周 榮，詹文勇 ，胡孝義

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.安徽省油茶良種工程技術(shù)研究中心，安徽 舒城 231340）

油茶Camellia oleifera是我國(guó)重要的木本油料樹種[1]，廣泛分布于我國(guó)南方各省區(qū)[2]。油茶秋季開花，春季果實(shí)才開始膨大，這期間缺少昆蟲等傳粉媒介，這對(duì)其坐果率有一定的影響[3]。因此，改變油茶的花期對(duì)于油茶生產(chǎn)具有重大意義。EMF2（EMBRYONIC FLOWER2）基因是植物抑制開花而維持正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的一個(gè)應(yīng)激基因。當(dāng)EMF2基因的抑制作用解除后，植物才能實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變[4-5]。有關(guān)研究者發(fā)現(xiàn)，EMF2基因編碼PcG蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，該復(fù)合物能引發(fā)許多與開花相關(guān)基因的抑制基因位點(diǎn)的核小體組蛋白H3K27me3（組蛋白H3的N端第27位賴氨酸的3甲基化）水平[6-7]。H3K27me3標(biāo)記由PRC2復(fù)合物引發(fā)，被PRC1樣復(fù)合物識(shí)別并維持[8-10]，它們的功能缺失都能減弱或消除H3K27me3，導(dǎo)致幼嫩的芽苗也能夠分化出花器官。因此，有關(guān)CoEMF2的研究對(duì)于油茶開花機(jī)理的研究具有重要意義。擬南芥EMF2蛋白正是PRC2復(fù)合物的核心組件[11]，而目前有關(guān)油茶EMF2基因的研究尚未見諸報(bào)道。為此，筆者基于茶樹Camellia sinensis EMF2同源基因的一個(gè)片段，采用 3′RACE（RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends） 和 5′RACE技術(shù)對(duì)CoEMF2 基因的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆，同時(shí)對(duì)基因全長(zhǎng)和編碼蛋白進(jìn)行序列分析與理化性質(zhì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CoEMF2蛋白中含有VEFS-Box結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指蛋白兩個(gè)保守區(qū)，這為油茶從芽到開花的誘導(dǎo)的進(jìn)一步研究提出了新思路。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料為“華鑫”油茶的組織培養(yǎng)幼苗[12]，來(lái)自中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方 法

1.2.1 油茶葉片的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Invitrogen的總RNA提取Kit(12183-018)，并加入CTAB（Cetyltrimethyl Ammonium Bromide上海生工生物工程有限公司），以裂解法提取油茶葉片的總RNA，再用Invitrogen的RACE Kit（18373-019）、（18374-058）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 特異引物設(shè)計(jì)及RACE擴(kuò)增

參照茶樹Camellia sinensis EMF2基因的一個(gè)片段，設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE的首輪及巢式特異引物（見表1）。

表1 特異引物序列Table 1 Sequence of special primers

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：5×HS PCR Buffer（Mg+plus）5.0 μL，dDTP Mixture（2.5 mM） 2.0 μL，primer（10 μM）0.5 μL，AUAP（10 μM）0.5 μL，模版 1.0 μL，PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，滅菌蒸餾水15.75 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，分別在72、70、68 ℃下退火30 s，72 ℃延伸80 s，每個(gè)退火溫度各循環(huán)5次；94 ℃變性30 s，65 ℃下退火30 s，72 ℃延伸80 s，20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃下保存。

電泳檢測(cè)巢式PCR結(jié)果，采用Ambiogen公司的Puprep Gel Extraction Kit回收和純化目的條帶，連接于TransGen公司的pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector載體后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，于37 ℃下培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并將含有目的片段的陽(yáng)性克隆送至博尚公司測(cè)序。

1.2.3 目的基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及分析

將測(cè)序得到的EMF2基因3′端和5′端序列進(jìn)行拼接，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，獲得油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。利用Vector NTI軟件獲得油茶EMF2基因理論上的開放讀碼框，并進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；用AnthePro5.0軟件對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；在網(wǎng)址http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl上分析和預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性；采用網(wǎng)址http：//www.predictprotein.org/分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；在網(wǎng)址http：//cello.life.nctu.edu.tw上進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 油茶葉片總RNA的提取結(jié)果

油茶葉片總RNA提取后的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，28 S與18 S條帶清晰明亮，兩者的總亮度約處于2∶1的狀態(tài)中，符合反轉(zhuǎn)錄和RCAE的實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 油茶葉片總RNA提取結(jié)果Fig.1 Detection of total RNA in C. oleifera leaf

2.2 目的基因的 3′RACE 與 5′RACE

3′RACE首輪PCR電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，雖然有兩個(gè)大小不同的條帶，但經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增后，檢測(cè)到的僅有單一清晰的條帶，約900 bp，進(jìn)一步進(jìn)行巢式PCR驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)計(jì)的相符（如圖2左所示）。5′RACE產(chǎn)物目的條帶十分明亮，約1 700 bp，如圖2右所示。

圖2 3′RACE產(chǎn)物與5′RACE產(chǎn)物的電泳圖Fig.2 Electrophoresis distribution of 3′RACE and 5′RACE products

2.3 CoEMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列分析

3′RACE 和 5′RACE 測(cè) 序 得 到 892 和 1 801 bp的片段，將二者進(jìn)行拼接，獲得序列2 210 bp（如圖3所示，圖3的方框?yàn)槠鹗己徒K止密碼子，下劃線為PolyA尾），包含1個(gè)完整的1 866 bp CDS 及 37 bp 5′UTR 和 307 bp 3′UTR，編碼621個(gè)氨基酸。將其與其它物種EMF2氨基酸序列進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與茶樹、葡萄、毛果楊的同源性分別高達(dá)97%、80%、81%。因此推測(cè)，該序列為油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

通過(guò)NCBI在線比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，油茶EMF2蛋白含有一個(gè)高度保守的VEFS-Box家族區(qū)域（如圖4所示）。其中VEFS是VRN2-EMF2-FIS2-Su(z)12的簡(jiǎn)稱，VRN2（VERNALIZATION2）為春化作用相關(guān)基因[13]、FIS2（FERTILIZATION INDEPENDENT SEEDS2）是胚乳發(fā)育相關(guān)基因[14]、Su(z)12是染色質(zhì)表達(dá)及精細(xì)胞形成的相關(guān)基因[15]。

與其它植物該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)樹分析，結(jié)果如圖5所示。圖5表明，油茶與茶樹EMF2的親緣關(guān)系最接近，在氨基酸序列和保守元件VEFS-Box上也極為相似。根據(jù)上述分析結(jié)果可以初步斷定，所獲得的序列為油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并命之名為CoEMF2。

圖3 油茶EMF2基因的全長(zhǎng)cDNAFig.3 Full-length cDNA sequence of C.oleifera EMF2 gene

圖4 油茶EMF2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domains in C. oleifera EMF2 protein

圖5 油茶與其它物種EMF2的親緣進(jìn)化關(guān)系Fig.5 Phylegenetic tree of EMF2 in C. oleifera and other species

2.4 理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

借助在線軟件分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：CoEMF2的ORF編碼621個(gè)氨基酸，分子量為70.54 KD；等電點(diǎn)為6.17，其中負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）的數(shù)目為78，正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）的數(shù)目為70；分子式可寫成C3108H4875N867O936S37；不穩(wěn)定系數(shù)為53.04，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

疏水性的分析結(jié)果如圖6所示。圖6表明，CoEMF2蛋白的疏水指數(shù)從－2.733到2.978（橫坐標(biāo)為氨基酸順序，縱坐標(biāo)為親、疏水值；“－”表示親水性，“＋”表示疏水性），疏水區(qū)大于親水區(qū)，因此推測(cè)，CoEMF2為疏水性蛋白。該蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)域：分別位于N端的137～153位，方向由外向內(nèi)；C端的573～591位，跨膜方向由內(nèi)向外（如圖7所示）。

圖6 油茶EMF2蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果Fig.6 Hydrophobicity analysis of C. oleifera EMF2 protein

圖7 油茶EMF2蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Prediction on membrane-spanning region in C. oleifera EMF2 protein

卷曲螺旋預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CoEMF2蛋白質(zhì)中可能存在8個(gè)較為明顯的螺旋結(jié)構(gòu)。Predictprotein軟件預(yù)測(cè)的CoEMF2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖8所示。圖8中，H表示α螺旋，E表示β折疊，L表示無(wú)規(guī)則卷曲。該蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)為21.74%，β折疊10.95%，無(wú)規(guī)則卷曲及其它結(jié)構(gòu)67.31%。CoEMF2蛋白的312-333位氨基酸處存在一個(gè)C2H2型鋅指蛋白（Zinc finger protein），該蛋白依靠其指型空間結(jié)構(gòu)伸入到DNA雙螺旋的大溝內(nèi)，通過(guò)α螺旋與DNA的堿基形成特異性接觸[16]，有助于PRC2復(fù)合體結(jié)合到染色質(zhì)上，進(jìn)而對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記修飾。

2.5 亞細(xì)胞定位和修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在http：//cello.life.nctu.edu.tw網(wǎng)址上對(duì)CoEMF2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果見表2。由表2可知，其位于細(xì)胞核中的可靠性最高。運(yùn)用KinasePhos軟件在線對(duì)CoEMF2蛋白序列修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明了含有55個(gè)絲氨酸激酶、25個(gè)蘇氨酸激酶、15個(gè)酪氨酸激酶潛在磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)組氨酸磷酸化位點(diǎn)，這說(shuō)明該蛋白被磷酸化修飾的可能性很大。

圖8 油茶EMF2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Secondary structure predictions in C. oleifera EMF2 protein

表2 油茶CoEMF2基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Prediction on subcellular localization in C. oleifera CoEMF2

3 結(jié)論與討論

本研究克隆了CoEMF2基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：開放閱讀框?yàn)? 866 bp，編碼621個(gè)氨基酸，蛋白分子量為70.54 kD，其為不穩(wěn)定的疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CoEMF2位于細(xì)胞核中，這與CoEMF2對(duì)于染色質(zhì)進(jìn)行H3K27me3的功能執(zhí)行是相一致的。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CoEMF2蛋白中含有兩個(gè)保守區(qū)：VEFS-Box結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指蛋白。CoEMF2蛋白具有VEFS-Box家族基因的保守域結(jié)構(gòu)特征：通過(guò)抑制AP1(APETALA1)、CAL(CAULIFLOWER)、FUL(FRUITFULL)等基因的作用從而抑制植物開花[17-18]。同時(shí)，VEFS-Box結(jié)構(gòu)域很可能結(jié)合鋅指蛋白一起參與到油茶開花的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程中。由于CoEMF2基因在結(jié)構(gòu)和功能上與Su(z)12基因相似，編碼PcG蛋白復(fù)合體，而PcG蛋白復(fù)合體的下游靶基因中，有開花同源基因AG（AGAMOUS）、AP3（APETALA3）和PI（PISTILLATA）[19-20]，所以推測(cè)，CoEMF2也會(huì)通過(guò)對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記修飾（例如H3K27me3）來(lái)實(shí)施對(duì)這些下游基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而控制營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化[21]。

CoEMF2參與組成的PRC2復(fù)合物催化H3K27me3的形成，并抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。若能在體細(xì)胞胚培養(yǎng)過(guò)程中減弱或消除H3K27me3標(biāo)記，就可能會(huì)增強(qiáng)胚性基因的表達(dá)，從而提高脂肪酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平[22-23]。因此，本研究不僅為今后有關(guān)油茶從芽到開花的誘導(dǎo)問(wèn)題的進(jìn)一步研究提出了新的思路，也為研究油茶愈傷組織的成脂效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

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