朱鳳云，陳鴻鵬，譚曉風

（1.黃淮學院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；2.國家林業(yè)局 桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；3. 中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004）

在當前全球化石能源枯竭、環(huán)境污染嚴重的情況下,人們開始尋找新的可再生能源，植物能源的開發(fā)研究已成為當今新能源研究的熱點之一[1]。

油桐Vernicia fordii為大戟科木本油料植物，是我國特有的重要工業(yè)油料樹種。桐果含油量高，全干桐仁的含油率高達71.91%。油桐種子榨取的桐油中不飽和脂肪酸含量達94% , 其中，α-桐酸含量占脂肪酸總量的80%左右[2]。由于α-桐酸是一種含有共軛雙鍵的不飽和脂肪酸，所以桐油極易在空氣中被氧化聚合生成致密的保護漆膜。因此，桐油是植物油中最優(yōu)質(zhì)的干性油，是制造優(yōu)質(zhì)油漆和油墨的基本原料，可用于制取大規(guī)模集成電路板的浸漬材料，同時還是制造生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，可以緩解我國能源短缺的問題，是一種很有潛力的生物質(zhì)能源樹種[3-4]，并且已開展了相關(guān)的分子生物學研究[5-6]。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12），又名亞油酸：氧氧化還原酶，俗稱脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶或類胡蘿卜素氧化酶，1932年首次發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中[7-9]。脂氧合酶在真核生物中參與不飽和脂肪酸的代謝，是動植物體內(nèi)催化脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，也是茉莉酸合成途徑的關(guān)鍵酶[8,10]，植物膜脂中富含的亞油酸和亞麻酸是其主要的反應(yīng)底物[11-18]。研究表明，LOX在植物的生長、發(fā)育、衰老以及環(huán)境脅迫反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用，引起了植物學界的廣泛興趣，其基因表達和調(diào)控也已經(jīng)成為研究真核生物基因表達的模式系統(tǒng)[14,19-20]。目前，已在小麥、玉米、獼猴桃、番茄、桃、大豆、沙梨、油橄欖等植物種子中發(fā)現(xiàn)脂氧合酶的存在，并對LOX基因進行了初步研究。本研究中對油桐種子中LOX基因的全長cDNA進行了克隆和生物信息學分析，旨在為油桐生長過程中的該基因功能及其對油脂品質(zhì)的影響等相關(guān)研究的開展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

本試驗中以油桐的近成熟種子為材料。2011年9月下旬，采自于湖南省湘西自治州的種質(zhì)資源庫，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Prime-star高保真酶購自Takara公司；感受態(tài)細胞為大腸桿菌DH5α、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒等購自Ambio公司；100 bp plus DNA Ladder購自Takara公司；DNase、RNA提取試劑盒、5′RACE 和 3′RACE 試劑盒購自 Invitrogen 公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；pEASYBlunt Simple克隆載體購自北京全式金公司；其它生化試劑和常規(guī)試劑如DEPC、H2O、Tris、EDTA、無水乙醇、EB、巰基乙醇等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 生物信息學軟件

Vector NTI 11.0、GENEDOC、Gene Tree、Chromas、Primer Premier 5.0以及Anteprot 5.0等。

1.2 方 法

1.2.1 油桐種子cDNA 的制備

將超低溫保存的油桐種子迅速取出，在液氮中研磨成粉末，參照Total RNA Purification System的說明提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄、5′RACE以及3′RACE說明書，對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的總cDNA、5'cDNA及3'cDNA作為PCR擴增的模板。

1.2.2 Vf-LOX基因保守區(qū)片段的克隆

根據(jù)GenBank 基因庫中已公布的高等植物（油橄欖、大豆、擬南芥、葡萄等）的LOX基因序列的保守區(qū)，進行BLAST X比對分析，設(shè)計1對簡并引物，并由深圳華大基因公司合成。

Vf-LOX-F1： 5'-TATGACTATGCTTACTACAAT GAYTT-3'；

Vf-LOX-R1： 5'-CTTAGAGTKGGGCGRTTTG GRAGGT-3'。

以油桐種子cDNA為模板，選用Vf-LOX-F1與Vf-LOX-R1為引物進行PCR擴增?？傮w積50 μL的PCR 反應(yīng)體系：0.5 μL PrimeStar聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×PCR 緩沖液（Mg2+），4.0 μL dNTPs（各2.5 mmol/L），2.0 μL cDNA，1.0 μL Vf-LOX-F1（10 μmol/L），1.0 μL Vf-LOX-R1 （10 μmol/L），31.5 μL ddH2O。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性 10 s，68 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min；4 ℃保溫。之后在瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，并對目的產(chǎn)物進行回收、克隆和測序。

1.2.3 Vf-LOX基因5'端和3'端片段的克隆

根據(jù)已有基因片段，通過Primer Premier 5.0分別設(shè)計了Vf-LOX基因的3條5'RACE和2條3'RACE引物，由深圳華大基因公司合成并通過PAGE方式進行純化。

Vf -LOX基因的5'RACE特異引物設(shè)計如下。

Vf-LOX-GSP 1：5′-CCGACATCTTCAAGTGA CCAAACCGTT-3′；

Vf-LOX-GSP 2：5′-GAAGCTCCAACC TACTCTCCGATT - 3′；

Vf-LOX-GSP 3：5′-TGGGCGGGCATATTTG GA-3′。

Vf-LOX基因的3'RACE特異引物設(shè)計如下。

Vf-LOX-GSP 4：5′-GAGTGGCGGTGAAGGA TGACAATGCT-3′；

Vf-LOX-GSP 5：5′-TTGTCAAGGCATTCGTC AGATGAGGTC-3′。

以油桐種子5'RACE cDNA為模板，選用5' RACE引物與UPM為引物進行巢氏PCR擴增。50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系：0.5 μL PrimeStar聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×PCR 緩沖液（Mg2+），4.0 μL dNTPs（ 各 2.5 mmol/L），2.0 μL cDNA，1.0 μL Vf-LOX-GSP 1 （10 μmol/L），1.0 μL UPM （10 μmol/L），31.5 μL ddH2O。PCR 擴增條件：98 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃變性 10 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min；4 ℃保溫。在此次擴增之后，繼續(xù)用Vf-LOX-GSP 2和Vf-LOX-GSP 3做巢氏PCR，以提高產(chǎn)物純度，體系不變，并對5'RACE產(chǎn)物進行回收、克隆和測序。

同理，以3'RACE cDNA為模板，反應(yīng)體系同5'RACE，分別以AUAP和Vf-LOX-GSP 4、Vf-LOX-GSP 5為引物進行巢式PCR擴增。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min；4 ℃保溫，并對3'RACE產(chǎn)物進行回收、克隆和測序。

1.2.4 Vf-LOX基因的生物信息學分析

將擴增獲得的油桐基因片段利用軟件拼接以后，利用生物學軟件進行翻譯，得到所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用在線工具進行蛋白質(zhì)序列的功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

2.1.1 RNA檢測

取3μL的RNA樣品在1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1中可以看出，油桐種子中所提取的總RNA樣品電泳條帶清晰，5.8S含量很少，表明降解很少，特別是28S和18S的比例基本呈2∶1的狀態(tài)，具有較高的純度和完整性，可以作為后續(xù)cDNA反轉(zhuǎn)錄的模板。

圖1 總RNA的電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA

2.1.2 基因片段的擴增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用Vf-LOX-F1、Vf-LOX-R1引物組合進行PCR擴增，得到1條約1700bp的片段。將此基因片段進行克隆和測序獲得序列信息，經(jīng)Vector NTI 11.0和NCBI Blast進行比對分析后，確認此序列片段是LOX基因的保守區(qū)部分片段（見圖2）。

以 5′RACE cDNA 為模板，5′RACE引物 與UPM為引物進行巢氏PCR擴增后，獲得了條帶清晰特異、大小約為1100bp的DNA條帶（見圖3）。此外，利用獲得的已知序列設(shè)計特異性引物，用3′RACE技術(shù)從油桐種子cDNA中擴增出1條約600bp的產(chǎn)物（見圖4）。

圖2 LOX基因保守區(qū)片段電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of conserved region fragment in LOX gene

圖3 LOX基因的5′RACE片段電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of 5′RACE fragment in LOX gene

圖4 LOX基因的3′RACE片段電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of 3′RACE fragment in LOX gene

2.2 Vf-LOX基因的全長cDNA序列分析

將中間保守區(qū)段、5' RACE和3' RACE各片段測序結(jié)果去除載體序列部分進行拼接，獲得了油桐種子LOX基因的全長cDNA。應(yīng)用生物軟件Vector NTI 11.0分析測序結(jié)果得出，該基因cDNA全長2690bp， 包括5'非編碼區(qū)142 bp、3'非編碼區(qū)154 bp以及1個長2394 bp的編碼區(qū)和poly（A）尾巴（17bp），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，該基因開放閱讀框編碼797個氨基酸（見圖5）。

圖5 Vf-LOX基因的全長cDNA序列與蛋白質(zhì)序列的分析Fig.5 Full-length cDNA and deduced protein sequences in Vf-LOX gene

2.3 Vf-LOX基因的蛋白質(zhì)序列

對Vf-LOX基因進行ORF預(yù)測，并應(yīng)用Vector NTI 11.0將編碼部分翻譯成蛋白質(zhì)序列，并與其它不同來源的LOX進行比對分析，發(fā)現(xiàn)油桐LOX序列與其它物種LOX基因同源性較高，如其編碼的氨基酸序列與茶、葡萄、辣椒、馬鈴薯的LOX氨基酸序列的同源性達99%，與橄欖、煙草、番茄、獼猴桃的LOX氨基酸序列的同源性達98%，由此，可推測該片段是LOX基因。

此外，脂氧合酶基因家族根據(jù)其催化亞油酸中加氧位置的不同，分為9-LOX、13-LOX2種類型[16]，9-LOX和13-LOX在序列長度上有差異，13-LOX在N端含有額外約60個氨基酸殘基[18]。在對油桐LOX序列的分析中，發(fā)現(xiàn)其N端缺少約40個氨基酸殘基（見圖6），推測其應(yīng)屬于9-LOX。另外，根據(jù)氨基酸序列分析結(jié)果，該酶在C-末端具有和其它物種的高保守區(qū)GIPNSVSI，序列中還存在幾個高保守性的區(qū)域，如底物結(jié)合區(qū)KSAWRTDEEFAREMLA（氨基酸366～379）、氧結(jié)合區(qū)IASALHAAVNFGQ（氨基酸719～729），Siedow 等認為它們同酶的催化作用相關(guān)[16]。

圖6 Vf-LOX與不同植物LOX的蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果Fig.6 Comparison of LOX protein sequences in Vernicia fordii and other plants

2.4 分子系統(tǒng)進化聚類分析

為探討油桐LOX與其它植物同類基因的親緣關(guān)系和可能的作用方式，應(yīng)用AlignX軟件對該基因編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥、大豆、油菜、茶葉等物種的已知基因氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果見圖7。圖7中結(jié)果顯示，這些植物的LOX在進化上主要形成了3個分支，其中第1個分支又分成了2個分支：擬南芥和油菜親緣較近，之后與大豆聚為1類，再與棉花聚合成1個亞分支；棉花，煙草與馬鈴薯聚為1類，之后與辣椒聚為1類，再與油橄欖聚合成1個亞分支；油桐與茶進化關(guān)系最近，聚在一起形成1個分支；葡萄單獨成為1個分支。

圖7 油桐與其它植物LOX的進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of LOX Vernicia fordii and other plants

運用生物軟件Antheprot 5.0對油桐LOX的蛋白質(zhì)序列進行理化性質(zhì)的分析，發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為91 423.339 Da；理論等電點5.415（見圖 8）；在 34、227、465、502、651、715 aa處等發(fā)現(xiàn)了信號肽剪位點（見圖9），其中715 aa處可能性最大。639～648 aa為跨膜區(qū)（見圖10），從而使LOX可以跨膜去行使功能。

利用在線分析軟件http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl， 選 擇 Hphob./Kyte& Doolittle 模式，對油桐LOX蛋白的疏水性進行分析預(yù)測，疏水性分析結(jié)果如圖11所示，該蛋白的疏水指數(shù)從－2.978到2.567，約在第50、648、712 位表現(xiàn)出較強的疏水性，在第92、620、765 位表現(xiàn)出較強的親水性。對Vf-LOX進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，油桐LOX主要在細胞內(nèi)的葉綠體、細胞質(zhì)中分布（見表1），且以細胞質(zhì)為主，這與其它物種該基因相關(guān)研究結(jié)論是一致的[8]。

圖8 Vf-LOX等電點的預(yù)測Fig.8 Prediction of isoelectric point of Vf-LOX

經(jīng)過三維建模和在線結(jié)構(gòu)工具分析，用VMD軟件優(yōu)化后，得到了Vf-LOX的3D結(jié)構(gòu)（見圖12）。從圖12中可以看出，此蛋白經(jīng)過幾次折疊后，主要以α螺旋為主，包括長螺旋（深色柱狀部分）和短螺旋（灰色柱狀部分），并伴有一些β折疊（淺色帶箭頭片狀部分），其間由一些轉(zhuǎn)角等相互連接（深色和淺色線條部分）。

圖9 Vf-LOX的信號肽剪切位點的預(yù)測Fig.9 Prediction of spliced site for signal peptide in Vf-LOX

圖10 Vf-LOX跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.10 Prediction of transmembrane domain in Vf-LOX

圖11 Vf-LOX的疏水性分析Fig.11 Hydrophobicity analysis of Vf-LOX

3 結(jié)論與討論

脂氧合酶基因廣泛存在于植物中，它參與不飽和脂肪酸的代謝，參與催化脂質(zhì)的降解與茉莉酸的合成，與植物的生長、發(fā)育過程關(guān)系密切，由于脂氧合酶對油脂的氧化作用，其對油脂品質(zhì)影響也較大[6-7]。目前，大量的研究工作主要是集中于酶的活性等生理學方面，但迄今尚不完全清楚該酶的生理功能，尤其是對脂質(zhì)合成代謝的調(diào)控作用研究不多。LOX在不同的組織或同一組織的不同發(fā)育階段有不同的表達模式，利用分子生物學技術(shù)，獲取種子中該基因的序列信息，從分子水平揭示該基因在植物果實成熟衰老及脂質(zhì)降解進程中的作用，對脂氧合酶的調(diào)控機理的研究也具有重要的意義[6,8]。本研究中對油桐種子進行該基因的克隆分析，獲得油桐LOX基因的cDNA片段序列, 長度為2 111 bp，編碼604個氨基酸,起終止密碼子為TAA。該序列與其它物種進行相似性比較后發(fā)現(xiàn)相似性非常高。在本研究中，從油桐果實中成功地克隆了LOX基因的中間保守區(qū)段、5'端部分和3'端的部分序列，并通過序列拼接獲得了LOX基因的全長cDNA序列。

表1 Vf-LOX的亞細胞定位預(yù)測分析Table 1 Location prediction for Vf-LOX at sub-cellular level

圖12 Vf-LOX的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.12 Prediction of 3D structure of Vf-LOX

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