楊久仙 ，曹靖

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

葡 萄 糖 氧 化 酶 （Glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，簡稱 GOX）為需氧脫氫酶 ，也稱葡糖氧化酶，其系統(tǒng)命名為β－D－葡萄糖氧化還原酶。GOX是從特異青霉（Penicillium notatum）等霉菌和蜂蜜中發(fā)現(xiàn)的酶，在氧氣存在的情況下能高度專一性地催化β－D－葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫［1］，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工程、食品添加劑、動(dòng)物飼料添加劑、生化材料、檢測試紙和生物傳感器等方面［2，3］。GOX廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，其中微生物（黑曲霉和青霉）以其生長繁殖快、分布廣泛的特點(diǎn)成為生產(chǎn)GOX的主要來源。

1 GOX制備方法進(jìn)展

葡萄糖氧化酶主要存在于微生物體內(nèi)，動(dòng)植物體內(nèi)含量不豐富，提取也有一定的局限性。霉菌作為普通微生物，培養(yǎng)簡單，生成的GOX較多，可以大規(guī)模生產(chǎn)?，F(xiàn)階段主要用于制備GOX的微生物是霉菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉菌（Penicillium notation）［4，5］。

從黑曲霉中生產(chǎn)制備GOX的工藝流程為：

黑曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)→過濾，留濾液→酸化至pH為4.0～4.5→離子交換柱分離→緩沖液洗脫→離心→收集飽和沉淀液→結(jié)晶→冷凍干燥→成品

成品活性檢測方法主要有：分光光度法、熒光法、電化學(xué)法等，在測定中影響測定結(jié)果的主要因素有：溫度、pH、供氧量等。

2 GOX生物學(xué)特性及作用機(jī)理

高純度葡萄糖氧化酶為淡黃色粉末，分子量為160 000左右，每摩爾酶中含2mol FAD，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機(jī)溶劑，50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。一般制品中含有過氧化氫酶。酶在波長為377nm和455nm有最大吸光值，在熱、酸或堿處理后產(chǎn)生特殊的綠色，在紫外光下無熒光。固體酶制劑在0℃下至少可保存兩年，在－15℃下可保存8年。GOX的最適pH范圍為3～4，最適pH為5，沒有該酶的保護(hù)劑如葡萄糖存在或pH大于8或小于3，該酶將迅速失活。GOX的最適作用溫度為30～60℃。EDTA、KCN及 NaF不能阻抑該酶，但Hg2Cl2、AgCl、對氯汞苯甲酸和苯肼對酶有阻抑作用［1］。

在生物反應(yīng)體系中，GOX與過氧化氫酶（CAT）組成一個(gè)氧化還原酶系統(tǒng)。在氧氣存在條件下，GOX能氧化葡萄糖生成D－葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2，CAT作用于 H2O2分解生成 H2O和1／2 O2，H2O再與葡萄糖酸內(nèi)酯結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸。在該反應(yīng)中，GOX的特點(diǎn)是消耗氧氣，催化葡萄糖氧化。在CAT存在下，每克分子GOX消耗1克原子氧；沒有CAT存在時(shí)消耗1克分子氧；在乙醇和CAT存在下，也消耗1克分子氧［1］。

GOX的抗菌特性是由于反應(yīng)產(chǎn)物H2O2具有滅菌作用。提純物含有2分子的FAD，作為電子受體，除 O2外，也能與2，6－二氯酚靛酚反應(yīng)［1］。

GOX是葡萄糖氧化的特異性酶，對葡萄糖的氧化作用具有特異性。米氏常數(shù)Km較低（10～3 M）。由于生成H2O2的量一定，所以可以作為D－葡萄糖的定量試劑，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域和臨床檢測。

3 GOX的應(yīng)用

3.1 GOX在食品工業(yè)中的應(yīng)用

3.1.1 延長食品保質(zhì)期

美拉德反應(yīng)是食品產(chǎn)品褐變的主要原因。食品加工過程中，部分糖蛋白分解后，還原糖的醛基和氨基酸的羧基發(fā)生反應(yīng)。在GOX過氧化氫酶系統(tǒng)下，食品中葡萄糖分子的醛基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?，生成葡萄糖酸，從而不能與氨基酸的羧基發(fā)生反應(yīng)而消除了美拉德反應(yīng)。因此，GOX過氧化氫酶系統(tǒng)在蛋品、薯類制品、果醬制品以及海鮮制品中應(yīng)用廣泛，對產(chǎn)品保質(zhì)期的延長具有重要作用［1］。如在制作脫水蛋粉時(shí)，利用GOX氧化除去在脫水與貯存過程中蛋粉存在的少量葡萄糖，防止其與蛋粉蛋白中氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，從而防止了褐變反應(yīng)的發(fā)生［6］。

在包裝食品中也廣泛應(yīng)用葡萄糖氧化酶。在瓶裝及罐裝食品中，多酚氧化酶和過氧化氫酶在有氧氣時(shí)會(huì)發(fā)生作用而引起食品質(zhì)量變質(zhì)。添加少量的葡萄糖氧化酶，消耗氧氣，可阻止產(chǎn)品質(zhì)量惡變。在粉狀包裝食品（瓶裝及罐裝）貯存時(shí)，因密封性差，在薄膜及包裝紙表面附葡萄糖氧化酶，可以去除氧氣，提高食品的保存效果。

3.1.2 保護(hù)還原性物質(zhì)

果汁、茶飲料、葡萄酒、啤酒、蛋黃醬、果醬等食品中含有黃酮、亞油酸、亞麻酸等還原性物質(zhì)，這些還原性物質(zhì)在有氧條件下發(fā)生氧化反應(yīng)，會(huì)使這些食品渾濁、沉淀、變色。在加工過程中加入適量GOX或GOX－過氧化氫酶復(fù)合物，可保護(hù)食品中的還原性物質(zhì)，有效地去除此類氧化反應(yīng)。

在啤酒生產(chǎn)中，GOX能防止啤酒氧化，保持啤酒風(fēng)味，延長保質(zhì)期。其主要作用機(jī)理是除去啤酒中的溶解氧和瓶頸氧，阻止啤酒生產(chǎn)過程中的氧化變質(zhì)，使氧與啤酒中的葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯而消耗溶解氧，反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖酸內(nèi)酯，性質(zhì)穩(wěn)定，不具有氧化能力，沒有酸味，無毒副作用，對啤酒的質(zhì)量沒有影響。GOX具有酶作用的專一性，不會(huì)對啤酒中其他物質(zhì)產(chǎn)生作用［7］。

葡萄酒和葡萄汁的生產(chǎn)中也廣泛應(yīng)用葡萄糖氧化酶。GOX消耗葡萄酒中的氧，阻止微生物的生長，提高紅葡萄酒的穩(wěn)定性。在白葡萄酒的生產(chǎn)中，GOX的作用尤為重要。由于白葡萄酒的生產(chǎn)原料葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽中含有較多的酚類和多酚氧化酶，有氧氣存在，就會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，加入GOX－CAT體系，可有效地去除氧，防止褐變反應(yīng)的發(fā)生。

GOX也應(yīng)用于果汁和蔬菜汁的生產(chǎn)中。Vc是果汁和蔬菜汁中含有的主要的營養(yǎng)元素之一，但它容易被溶解在果汁和蔬菜汁中的氧氧化破壞，添加適量的GOX與葡萄糖，可有效地保護(hù)Vc不被氧化［8］。

3.1.3 殺菌作用

GOX能消耗環(huán)境中的氧，阻止好氧菌生長繁殖，產(chǎn)生過氧化氫，從而起到殺菌作用。

3.1.4 提高外觀品質(zhì)和適口性

GOX催化葡萄糖氧化反應(yīng)生成葡萄糖酸和強(qiáng)氧化劑過氧化氫。過氧化氫使面筋分子中的巰基（·SH）氧化成為二硫鍵（·S－S·），明顯改善面粉的粉質(zhì)曲線特性、拉伸曲線特性。所以，GOX可以作為面粉改良劑和面包品質(zhì)改良劑。GOX在面粉和各類制品生產(chǎn)中，如焙烤面包、面條制作及各種高面筋面粉的生產(chǎn)都有應(yīng)用，均有理想效果，可替代各種化學(xué)添加劑（溴酸鉀等），降低成本。在面粉中添加GOX，可以改良面粉品質(zhì)，強(qiáng)化面粉的筋力，增加面團(tuán)的耐機(jī)械性能，使面團(tuán)更柔軟、穩(wěn)定，具有良好的操作性，面包的比容和質(zhì)量都有相應(yīng)改善，同時(shí)，還可以提高面包的入爐急脹性，增大面包的體積，改善面包的色澤以及內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)。GOX比溴酸鉀對面包的抗老化性能效果好［9，10］。

3.1.5 葡萄糖的定量分析

GOX對底物具有嚴(yán)格的專一性，能專一氧化葡萄糖，故可用于測定各種食品和混合物中葡萄糖的含量。目前用固定化技術(shù)制成的GOX分析儀已用于測定發(fā)酵液中葡萄糖的殘?zhí)橇浚?1］。據(jù)此原理制成的葡萄糖測定試劑盒，可定量測定果汁、飲料及牛奶等多種食品中葡萄糖的含量。

3.2 動(dòng)物飼料添加劑

配合飼料中常添加多種維生素、魚粉和油脂類，以平衡蛋白質(zhì)、維生素和無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分。但是，一些成分如脂肪、維生素A、胡蘿卜素等容易氧化變質(zhì)，甚至產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，危害畜禽健康。安全性高、效果好的抗氧化劑在飼料中的添加可以有效地避免其不利影響、減少飼料營養(yǎng)物質(zhì)損失和氧化變質(zhì)。GOX作為一種抗氧化劑，已應(yīng)用于畜牧業(yè)中。

3.2.1 延長飼料保存時(shí)間

GOX的催化反應(yīng)過程中可以生成H2O2同時(shí)消耗大量的氧氣［4］，能夠起到殺菌的作用。豬全價(jià)配合飼料中含有大量的玉米、豆柏等易霉變原料和脂肪、維生素等易氧化變質(zhì)成分，H2O2具有的高效的殺菌能力，可以抑制霉菌，降低霉菌毒素的含量，同時(shí)低氧的環(huán)境可減少飼料的營養(yǎng)的損失［12］。

3.2.2 改善胃腸道pH值

GOX催化葡萄糖生成葡萄糖酸，可以作為胃腸道中的酸化劑。飼料中添加的GOX進(jìn)入胃腸道后，發(fā)生氧化反應(yīng)，不斷產(chǎn)生葡萄糖酸，使胃腸道pH值降低。在偏酸的環(huán)境中，各種消化酶的活性都得到極大發(fā)揮，有助于飼料的消化［13］。G Biagi等通過體外試驗(yàn)報(bào)道了葡萄糖酸在仔豬上的應(yīng)用，經(jīng)過4h、8h和24h的發(fā)酵試驗(yàn)，盲腸液中的氨顯著減少；發(fā)酵24h后，總脂肪酸、乙酸、丙酸、n－丁酸、乙酸丙酸比、乙酸＋丁酸與丙酸比都極顯著的增加［14］。

3.2.3 維持腸道菌群生態(tài)平衡

GOX在催化腸道內(nèi)的葡萄糖發(fā)生反應(yīng)的過程中消耗腸道內(nèi)的氧氣，為厭氧有益菌的生長創(chuàng)造有利環(huán)境。反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖酸還可降低胃腸內(nèi)pH值，為乳酸菌生長創(chuàng)造酸性環(huán)境，乳酸菌的大量生長有利于飼料的消化。同時(shí)，反應(yīng)生成的過氧化氫還具有滅菌作用，當(dāng)過氧化氫積累到一定濃度時(shí)，直接抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌和弧菌的生長繁殖［15］。GOX在維持腸道菌群生態(tài)平衡中使有益菌大量增殖，抑制有害菌的生長，從而防止了有害菌的感染，提高了機(jī)體的免疫力。GOX可有效防治豬的生理性頑固腹瀉。

3.2.4 保護(hù)腸道上皮細(xì)胞完整，提高飼料的吸收效率

豬處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧化自由基，引起腸道上皮細(xì)胞破壞。GOX具有抗氧化作用，能清除自由基，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞完整，從而阻擋病原體的侵入，提高腸道對飼料的吸收效率［16，17］。楊久仙等GOX對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響研究中發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.3%的GOX日增重提高8.2%（P＜0.05）；飼料轉(zhuǎn)化效率趨于提高（7.9%，0.05＜P＜0.15）［18］。

3.2.5 解除中毒反應(yīng)

GOX不僅可以解除霉菌毒素中毒反應(yīng)還可以解除其他藥物中毒反應(yīng)。GOX直接抑制黃曲霉、黑根霉、青霉等多種霉菌，對黃曲霉毒素B中毒癥有很好的預(yù)防效果。豬食用發(fā)霉飼料后，毒素會(huì)造成胃腸道疾病，同時(shí)免疫力下降引發(fā)各種病原的共同感染，導(dǎo)致免疫抑制反應(yīng)。飼料中添加GOX，可以一定程度地解除飼料中真菌毒素的危害，提高動(dòng)物免疫力。GOX也能解除藥物中毒，其作用原理是，GOX進(jìn)入消化道，其中一部分進(jìn)入肝臟，催化肝臟內(nèi)的氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，加速了毒性成分的分解［19］。

3.2.6 減少抗生素的使用

豬的大規(guī)模集約化飼養(yǎng)增加了疾病的易感性，使生產(chǎn)中不得不使用大量抗生素?？股氐臑E用造成了大量耐藥性強(qiáng)的新型病原的出現(xiàn)，危機(jī)養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)發(fā)展；同時(shí)導(dǎo)致肉類產(chǎn)品的藥物殘留，危害人類健康。楊久仙等發(fā)現(xiàn)在豬的飼養(yǎng)過程中，添加適當(dāng)劑量的GOX可以減少或替代抗生素達(dá)到減少疾病發(fā)生率、提高生成性能的作用［18］。

3.3 檢測試紙應(yīng)用

3.3.1 尿糖測定試紙

尿糖試紙用于檢測尿液中的葡萄糖含量。其原理是，GOX酶促反應(yīng)過程中產(chǎn)生的過氧化氫可被過氧化氫酶催化分解，產(chǎn)生水和原子氧。氧原子可將試紙上吸附的無色還原性鄰聯(lián)甲苯胺染料氧化成藍(lán)色物質(zhì)。藍(lán)色物質(zhì)的生成量與葡萄糖濃度成正比，從而計(jì)算葡萄糖的量。

3.3.2 血糖測定試紙

目前已有商品化的GOX與過氧化物酶偶聯(lián)（GOX－POD）法測定血糖含量的試劑。試紙使用簡單、無毒、無害、易控制，臨床上已廣泛應(yīng)用。

3.4 生物傳感器

生物芯片中GOX電極傳感器和生物傳感器中GOX的應(yīng)用研究最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。GOX是生物傳感器領(lǐng)域最常用的工具酶。GOX生物傳感器可用于實(shí)時(shí)檢測發(fā)酵過程中葡萄糖的濃度，以控制食品加工生產(chǎn)過程中葡萄糖的含量［20］。GOX電極傳感器還可用于監(jiān)測植物種子中氧的消耗，主要根據(jù)GOX在反應(yīng)中消耗氧的量，應(yīng)用蛋殼膜傳感器來實(shí)現(xiàn)。此種方法干擾因素少，測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確［21，22］。土壤成分的測定中也可以應(yīng)用這種GOX電極傳感器，在酸性環(huán)境中，Hg與GOX活性中心的某些位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制酶活性，以測定土壤浸出液中汞離子的回收率［23］。GOX電極傳感器還廣泛用于免疫測定中［24，25］，根據(jù)單克隆抗體抗鏈霉素、青霉素及磺胺類藥物的原理，建立GOX半抗原快速測定技術(shù)，分析牛奶中的抗生素，具有專一、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)［26，27］。

3.5 醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

GOX和乳酸過氧化氫酶（LPO）、淀粉葡糖苷酶、葡聚糖酶、溶菌酶等酶制成的酶制劑可除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成。藥物中添加一定量的GOX，穩(wěn)定性可提高3倍。含有GOX、LPO和含碘化合物等成分的制劑，可制成口腔藥物，還可添加在化妝品中，具有抗頭皮屑的作用。含有GOX和LPO的雙酶口香糖，在咀嚼時(shí)抑菌率可達(dá)96%～99%。GOX也可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。作為試劑盒、酶電極等，GOX可用于體外血清（漿）、尿液及腦脊液中葡萄糖的大量分析［2］。

4 結(jié)語

GOX可以延長食品的保質(zhì)和保鮮期，其在食品中的應(yīng)用范圍可以進(jìn)一步擴(kuò)大。GOX在動(dòng)物體內(nèi)的作用機(jī)理、副作用有待進(jìn)一步研究。如何更經(jīng)濟(jì)、更有效地制備和提純GOX及其提純方法、范圍是今后研究的方向。隨著研究的不斷深入，GOX的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。

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